核酸結(jié)構(gòu)和功能

核酸結(jié)構(gòu)和功能第1頁(yè)/共90頁(yè)2.1DNA是主要的遺傳物質(zhì)

1869年Miescher從細(xì)胞核中分離出含磷很高的酸性化合物，稱為核素(nuclein)，1889年Altman制備了不含蛋白質(zhì)的核酸制品，命名為核酸(nucleicacid)。Miescher在1892年曾推測(cè)核酸可能是遺傳物質(zhì)，但遺憾的是1940年代之前，這一推論未能得到實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，也未得到學(xué)術(shù)界的重視。

1910年Kossel證明核酸的主要成分是核糖、磷酸和堿基，1924年Feulgen根據(jù)核酸所含核糖的結(jié)構(gòu)差別，將核酸分為核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)和脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)。

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Kossel的學(xué)生Levene于1909年發(fā)現(xiàn)酵母的核酸含有核糖，1929年發(fā)現(xiàn)核酸中的堿基主要是腺膘呤、鳥膘呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，并證明堿基、核糖、磷酸可以組成核苷酸，核酸則是由核苷酸組成的。1930年Levene發(fā)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞的核酸含有一種特殊的核糖即脫氧核糖,得出了一個(gè)錯(cuò)誤概念:植物核酸含核糖，動(dòng)物核酸含脫氧核糖。這個(gè)錯(cuò)誤概念一直延續(xù)到1938年，這時(shí)方清楚RNA和DNA的區(qū)別。Levene還提出了核酸的“磷酸-核糖(堿基)-磷酸”的骨架結(jié)構(gòu),解決了DNA分子的線性問題,并于1935年提出“四核苷酸”學(xué)說,認(rèn)為這四種核苷酸的聚合體是構(gòu)成核酸的基本單位，這一觀點(diǎn)當(dāng)時(shí)得到了廣泛認(rèn)同，一度阻礙了對(duì)核酸的研究工作。第3頁(yè)/共90頁(yè)

20世紀(jì)50年代以前，盡管已證明了生物體普遍含有DNA和RNA，但由于四核苷酸假說的影響，核酸的研究未能引起足夠重視。1943年Chargaff等證明DNA中4種堿基的比例并不相等，四核苷酸假說開始受到質(zhì)疑。1944年Avery重做1928年Griffith的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，從有致病能力的有莢膜細(xì)菌分離蛋白質(zhì)和DNA，分別加到無莢膜細(xì)菌(無致病能力)的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)有莢膜細(xì)菌的DNA，可以使無莢膜細(xì)菌轉(zhuǎn)化為有莢膜細(xì)菌，而蛋白質(zhì)沒有這種作用，說明DNA是遺傳物質(zhì)。第4頁(yè)/共90頁(yè)TheAvery-MacLeod-McCartyexperiment.Wheninjectedintomice,theencapsulatedstrainofpneumococcusislethal,whereasthenonencapsulatedstrain,liketheheat-killedencapsulatedstrain,isharmless.EarlierresearchbythebacteriologistFrederickGriffithhadshownthataddingheat-killedvirulentbacteria(harmlesstomice)toalivenonvirulentstrainpermanentlytransformedthelatterintolethal,virulent,encapsulatedbacteria.AveryandhiscolleaguesextractedtheDNAfromheat-killedvirulentpneumococci,removingtheproteinascompletelyaspossible,andaddedthisDNAtononvirulentbacteria.TheDNAgainedentranceintothenonvirulentbacteria,whichwerepermanentlytransformedintoavirulentstrain.第5頁(yè)/共90頁(yè)但由于四核苷酸假說的影響，這一結(jié)果一度受到質(zhì)疑，理由是：（1）因認(rèn)為蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，二十種氨基酸的排列組合將是個(gè)天文數(shù)字，可作為一種遺傳信息。而DNA相對(duì)分子質(zhì)量小，只含4種不同的堿基，人們一度認(rèn)為不同種的有機(jī)體的核酸只有微小的差異。（2）認(rèn)為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中DNA并未能提得很純，還附有其它物質(zhì)。（3）即使轉(zhuǎn)化因子確實(shí)是DNA，但也可能DNA只是對(duì)莢膜形成起著直接的化學(xué)效應(yīng)，而不是充當(dāng)遺傳信息的載體。

Avery的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，加入蛋白酶和去除脂類并不影響DNA引起的轉(zhuǎn)化作用，排除了上述質(zhì)疑，證明了DNA是遺傳物質(zhì)。第6頁(yè)/共90頁(yè)

1952年Hershey和Chase分別用35S標(biāo)記噬菌體T2的蛋白質(zhì)，用32P標(biāo)記噬菌體T2的DNA，然后感染大腸桿菌，說明噬菌體的DNA進(jìn)入細(xì)菌后，合成了由其編碼的外殼蛋白質(zhì)，進(jìn)一步證明DNA是遺傳物質(zhì)，其實(shí)驗(yàn)的過程如圖2-1所示。第7頁(yè)/共90頁(yè)

TheHershey-Chaseexperiment.TwobatchesofisotopicallylabeledbacteriophageT2particleswereprepared.Onewaslabeledwith32PinthephosphategroupsoftheDNA,theotherwith35Sinthesulfur-containingaminoacidsoftheproteincoats(capsids).(NotethatDNAcontainsnosulfurandviralproteincontainsnophosphorus.)Thetwobatchesoflabeledphagewerethenallowedtoinfectseparatesuspensionsofunlabeledbacteria.Eachsuspensionofphage-infectedcellswasagitatedinablendertosheartheviralcapsidsfromthebacteria.Thebacteriaandemptyviralcoats(called“ghosts”)werethenseparatedbycentrifugation.Thecellsinfectedwiththe32P-labeledphagewerefoundtocontain32P,indicatingthatthelabeledviralDNAhadenteredthecells;theviralghostscontainednoradioactivity.Thecellsinfectedwith35S-labeledphagewerefoundtohavenoradioactivityafterblendertreatment,buttheviralghostscontained35S.Progenyvirusparticles(notshown)wereproducedinbothbatchesofbacteriasometimeaftertheviralcoatswereremoved,indicatingthatthegeneticmessagefortheirreplicationhadbeenintroducedbyviralDNA,notbyviralprotein.第8頁(yè)/共90頁(yè)現(xiàn)已證明，除少數(shù)病毒以RNA為遺傳物質(zhì)外，多數(shù)生物體的遺傳物質(zhì)是DNA。原核生物的染色體是由一個(gè)環(huán)狀DNA分子和少量蛋白質(zhì)構(gòu)成的，真核生物的染色體則是由DNA和約等量的蛋白質(zhì)構(gòu)成的。此外，原核生物含有較小的質(zhì)粒DNA，真核生物的線粒體、葉綠體等細(xì)胞器也含有較小的DNA，細(xì)胞器DNA約占真核生物DNA總量的5%。不同生物體中DNA的結(jié)構(gòu)差別(或RNA病毒中RNA的結(jié)構(gòu)差別)，決定了其所含蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量有所差別，因而表現(xiàn)出不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)和代謝類型。

RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，核內(nèi)RNA只占RNA總量的約10%。RNA的主要作用是從DNA轉(zhuǎn)錄遺傳信息，并指導(dǎo)蛋白質(zhì)的生物合成。此外，近些年發(fā)現(xiàn)不少小分子RNA有重要的調(diào)節(jié)功能和催化功能。第9頁(yè)/共90頁(yè)2.2核酸的組成成分核酸可以水解成核苷酸，核苷酸可以水解成磷酸和核苷，核苷可以水解成戊糖和堿基，堿基可以分成多種類型。

2.2.1戊糖

RNA和DNA兩類核酸是因所含的戊糖不同而分類的，RNA含D-核糖，DNA含D-2-脫氧核糖。某些RNA中含有少量的D-2-O-甲基核糖，即核糖的第2個(gè)碳原子上的羥基已被甲基化，D-核糖和D-2-脫氧核糖的結(jié)構(gòu)式如圖2-2所示。第10頁(yè)/共90頁(yè)Conformationsofribose.Insolution,thestraightchain(aldehyde)andring(-furanose)formsoffreeriboseareinequilibrium.RNAcontainsonlytheringform,-D-ribofuranose.Deoxyriboseundergoesasimilarinterconversioninsolution,butinDNAexistssolelyas-2′-deoxy-D-ribofuranose.第11頁(yè)/共90頁(yè)在核酸中，戊糖的第一位與堿基形成糖苷鍵，形成的化合物稱核苷。在核苷中，戊糖中的原子編號(hào)改為1'，2'，3'……，以區(qū)別于各堿基雜環(huán)中的原子編號(hào)。核糖和脫氧核糖均為β-D-型呋喃糖，通常糖環(huán)的4個(gè)原子處于同一平面，另一個(gè)原子偏離平面，若突出的原子偏向C-5'一側(cè)，稱內(nèi)式(endo)，若偏向另一側(cè)則稱之為外式(exo)。DNA中的核糖通常為C-3'內(nèi)式，或C-2'內(nèi)式(圖2-3)第12頁(yè)/共90頁(yè)核酸中的堿基有嘌呤和嘧啶兩大類，圖2-4中嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)中各原子的編號(hào)是目前國(guó)際上普遍采用的統(tǒng)一編號(hào)。DNA和RNA均含有腺嘌呤和鳥嘌呤(圖2-4)，但二者所含的嘧啶堿有所不同，RNA主要含胞嘧啶和尿嘧啶，DNA則含胞嘧啶和胸腺嘧啶(5-甲基尿嘧啶，圖2-5，圖2-6)。第13頁(yè)/共90頁(yè)

某些類型的DNA含有比較少見的特殊堿基，稱稀有堿基。如小麥胚DNA含有較多的5-甲基胞嘧啶，在某些噬菌體(細(xì)菌病毒)中含有5-羥甲基胞嘧啶。稀有堿基是主要堿基經(jīng)過化學(xué)修飾生成的，因此也可稱作修飾堿基。在一些核酸中還存在少量的其它修飾堿基，如次黃嘌呤、二氫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)、4-硫尿嘧啶等。tRNA中的修飾堿基種類較多，含量不等，某些tRNA中的修飾堿基可達(dá)堿基總量的10％或更多。此外，修飾堿基常常扮演信號(hào)傳導(dǎo)信使分子、營(yíng)養(yǎng)因子、輔酶等角色，并對(duì)核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著重要作用。第14頁(yè)/共90頁(yè)第15頁(yè)/共90頁(yè)第16頁(yè)/共90頁(yè)含氧的堿基有烯醇式和酮式兩種互變異構(gòu)體(圖2-7)，在生理pH條件下主要以酮式存在。體內(nèi)核酸大分子中的堿基一般也是以酮式存在的。堿基可用英文名稱前3個(gè)字母表示，如腺嘌呤(adenine)為Ade，鳥嘌呤(guanine)為Gua，胞嘧啶(cytosine)為Cyt，尿嘧啶(uracil)為Ura，胞腺嘧啶(thymine)為Thy，亦可用英文名稱的第一個(gè)字母表示，分別為A、G、C、U和T，近些年單字符號(hào)使用更多。第17頁(yè)/共90頁(yè)2.2.3核苷

核苷(nucleoside)是戊糖和含氮堿生成的糖苷，核糖的1'碳原子通常與嘌呤堿的第9氮原子或嘧啶堿的第1氮原子相連。在tRNA中有少量尿嘧啶的第5位碳原子與核糖的1'碳原子相連，這是一種碳苷，因?yàn)槲焯桥c堿基的連接方式較特殊，也稱為假尿苷。

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由嘌呤形成的核苷可以有順式和反式兩種結(jié)構(gòu)類型，嘧啶形成的核苷只有反式構(gòu)象是穩(wěn)定的，在順式結(jié)構(gòu)中，C2位的取代基與糖殘基存在空間位阻(圖2-8)。第19頁(yè)/共90頁(yè)Thecommonribonucleosides—cytidine,uridine,adenosine,andguanosine.Also,inosinedrawninanticonformation.第20頁(yè)/共90頁(yè)核苷常用單字符號(hào)(A,G,C,U)表示，脫氧核苷則在單字符號(hào)前加一小寫的d(dA,dG,dC,dT)。常見的修飾核苷符號(hào)有：次黃苷或肌苷(inosine)為I，黃嘌呤核苷(xanthosine)為X，二氫尿嘧啶核苷(dihydrouridine)為D，假尿嘧啶核苷(pseudouridine)為ψ。取代基團(tuán)用英文小寫字母表示，堿基取代基團(tuán)的符號(hào)寫在核苷單字符號(hào)的左下角，核糖取代基團(tuán)的符號(hào)寫在右下角，取代基團(tuán)的位置寫在取代基團(tuán)符號(hào)的右上角，取代基的數(shù)量則寫在右下角。如5-甲基脫氧胞苷的符號(hào)為m5dC，而N6,N6-二甲基腺嘌呤的符號(hào)為m26A。第21頁(yè)/共90頁(yè)2.2.4核苷酸核苷酸的結(jié)構(gòu)和功能

核苷酸(nucleotide)是核苷的磷酸酯。核苷中的核糖有3個(gè)自由的羥基，均可以被磷酸酯化，分別生成2'-，3'-和5'-核苷酸。脫氧核苷酸的五碳糖上只有2個(gè)自由羥基，只能生成3'-和5'-脫氧核苷酸，各種核苷酸的結(jié)構(gòu)已經(jīng)用有機(jī)合成等方法證實(shí)。生物體內(nèi)的游離核苷酸多為5'-核苷酸(圖2-9)，所以通常將核苷-5'一磷酸簡(jiǎn)稱為核苷一磷酸或核苷酸。各種核苷酸在文獻(xiàn)中通常用英文縮寫表示，如腺苷酸為AMP，鳥苷酸為GMP。脫氧核苷酸則在英文縮寫前加小寫d，如dAMP,dGMP等。第22頁(yè)/共90頁(yè)第23頁(yè)/共90頁(yè)Structuresofthefourcommonribonucleotides—AMP,GMP,CMP,andUMP—togetherwiththeirtwosetsoffullnames,forexample,adenosine5'-monophosphateandadenylicacid.Alsoshownisthenucleoside3'-AMP.第24頁(yè)/共90頁(yè)第25頁(yè)/共90頁(yè)其他單核苷酸也可以產(chǎn)生相應(yīng)的二磷酸或三磷酸化合物。各種核苷三磷酸(ATP,GTP,CTP,UTP)是體內(nèi)RNA合成的直接原料，各種脫氧核苷三磷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)是DNA合成的直接原料。核苷三磷酸化合物在生物體的能量代謝中起著重要的作用，在所有生物系統(tǒng)化學(xué)能的轉(zhuǎn)化和利用中普遍起作用的是ATP。其它核苷三磷酸參與特定的代謝過程，如UTP參加糖的互相轉(zhuǎn)化與合成，CTP參加磷脂的合成，GTP參加蛋白質(zhì)和嘌呤的合成等等。生物體內(nèi)的AMP可與一分子磷酸結(jié)合，生成腺苷二磷酸(ADP)，ADP再與一分子磷酸結(jié)合，生成腺苷三磷酸(adenosinetriphosphate,ATP,圖2-10)。第26頁(yè)/共90頁(yè)FormationofADPandATPbythesuccessiveadditionofphosphategroupsviaphosphoricanhydridelinkages.NotetheremovalofequivalentsofH2Ointhesedehydrationsynthesisreactions.第27頁(yè)/共90頁(yè)P(yáng)hosphorylandpyrophosphorylgrouptransfer,themajorbiochemicalreactionsofnucleotides.腺苷酸也是一些輔酶的結(jié)構(gòu)成分，如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶I,NAD+)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(輔酶II,ANDP+）、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等。第28頁(yè)/共90頁(yè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的3',5'-環(huán)狀腺苷酸(3',5'-cyclicadenosinemonophosphate,cAMP)是一些激素發(fā)揮作用的媒介物，被稱為這些激素的第二信使。許多藥物和神經(jīng)遞質(zhì)也是通過cAMP發(fā)揮作用的。cGMP是cAMP的拮抗物，二者共同在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要的調(diào)節(jié)作用。某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)了cUMP和cCMP，功能不詳。環(huán)核苷酸是在細(xì)胞內(nèi)一些因子的作用下，由某種核苷三磷酸(NTP)在相應(yīng)的環(huán)化酶作用下生成的，cAMP和cGMP的結(jié)構(gòu)式如圖2-11所示。第29頁(yè)/共90頁(yè)第30頁(yè)/共90頁(yè)在細(xì)菌的培養(yǎng)基中缺少某種必需氨基酸時(shí)，幾秒鐘內(nèi)即發(fā)生GTP+ATP→ppGpp或pppGpp的反應(yīng)。在ppGpp或pppGpp的作用下，細(xì)菌會(huì)嚴(yán)格控制代謝活動(dòng)以減少消耗，加快體內(nèi)原有蛋白質(zhì)的水解以獲取所缺的氨基酸，并用以合成生命活動(dòng)必需的蛋白質(zhì)，從而延續(xù)生命。枯草桿菌在營(yíng)養(yǎng)不利的情況下形成芽孢時(shí)，合成ppApp，pppApp和pppAppp，使細(xì)菌處于休眠狀態(tài)度過惡劣時(shí)期。很多原核生物(如大腸桿菌)、真核生物(如酵母菌)和哺乳動(dòng)物都存在A5‘pppp5'A(Ap4A)，在哺乳動(dòng)物中Ap4A含量與細(xì)胞生長(zhǎng)速度有正相關(guān)。核苷酸及其衍生物在調(diào)控方面的作用，已成為生物體調(diào)控機(jī)制研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。第31頁(yè)/共90頁(yè)核苷酸的性質(zhì)核苷酸的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，故核苷酸在260nm左右有強(qiáng)吸收峰。由于堿基的紫外吸收光譜受堿基種類和解離狀態(tài)的影響，故測(cè)定核苷酸的紫外吸收時(shí)應(yīng)注意在一定的pH下進(jìn)行。圖2-12表示了四種核苷酸在不同pH下的紫外吸收光譜。利用堿基紫外吸收的差別，可以鑒定各種核苷酸。

第32頁(yè)/共90頁(yè)表2-1四種主要核苷酸可解離基團(tuán)的pK值核苷酸pK0(堿基-N)pk1(磷酸基)pK2(磷酸基)5′-AMP3.8(N-1)0.96.15′-GMP9.4(N-1),2.4(N-7)0.76.15′-CMP4.5(N-3)0.86.35′-UMP9.5(N-3)1.06.4第33頁(yè)/共90頁(yè)圖2-13是4種核苷酸的解離曲線?？梢钥闯?，當(dāng)pH處于第一磷酸基和堿基解離曲線的交點(diǎn)時(shí)，二者的解離度剛好相等。在這個(gè)pH下，第二磷酸基尚未解離，所以這一pH為該核苷酸的等電點(diǎn)。當(dāng)pH小于等電點(diǎn)時(shí)，該核苷酸帶凈正電荷。相反，如果pH大于核苷酸的等電點(diǎn)，則該核苷酸帶凈負(fù)電荷。第34頁(yè)/共90頁(yè)在pH3.5時(shí)，各種核苷酸的第一磷酸基已完全解離，帶1個(gè)單位的負(fù)電荷，第二磷酸基完全未解離。含氮堿基的解離度則有明顯的差別，分別為CMP(+0.84)>AMP(+0.54)>GMP(+0.05)>UMP(0)。這樣，所有核苷酸都帶凈負(fù)電荷，且?guī)ж?fù)電荷的多少各不相同。在pH3.5的緩沖液中進(jìn)行電泳，它們便以不同的速度向正極移動(dòng)，其移動(dòng)速度的順序是UMP>GMP>AMP>CMP，因而可以將它們分開。用陽(yáng)離子交換樹脂分離上述四種核苷酸時(shí)，先在低pH(例如pH1.0)下使它們都帶上凈正電荷(UMP除外)，經(jīng)離子交換作用結(jié)合到樹脂上，然后用pH或鹽離子濃度遞增的緩沖液進(jìn)行洗脫。UMP因不帶正電荷，首先被洗脫下來，接著是GMP，因?yàn)猷堰虱h(huán)同離子交換樹脂的非極性吸附比嘧啶環(huán)大許多倍，抵消了AMP和GMP之間正電荷的差別，故洗脫順序是：UMP→GMP→CMP→AMP。第35頁(yè)/共90頁(yè)2.3核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)證明DNA和RNA都是沒有分支的多核苷酸長(zhǎng)鏈，鏈中每個(gè)核苷酸的3'-羥基和相鄰核苷酸戊糖上的5'-磷酸相連。因此，核苷酸間的連接鍵是3',5'-磷酸二酯鍵(3',5'-phosphodiesterbond)。由相間排列的戊糖和磷酸構(gòu)成核酸大分子的主鏈，而代表其特性的堿基則可以看成是有次序地連接在其主鏈上的側(cè)鏈基團(tuán)。由于同一條鏈中所有核苷酸間的磷酸二酯鍵有相同的走向，RNA和DNA鏈都有特殊的方向性，而每條線形核酸鏈都有一個(gè)5'-末端和一個(gè)3'-末端(圖2-14)。第36頁(yè)/共90頁(yè)3',5'phosphodiesterbridgeslinknucleotidestogethertoformpolynucleotidechains.第37頁(yè)/共90頁(yè)核酸結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)寫式用簡(jiǎn)寫式表示核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，用p表示磷酸基團(tuán)，當(dāng)它放在核苷符號(hào)的左側(cè)時(shí)，表示磷酸與糖環(huán)的5'-羥基結(jié)合，右側(cè)表示與3'-羥基結(jié)合，如pApCpGpU。在表示核酸酶的水解部位時(shí)，常用這種簡(jiǎn)寫式。pApCp↓GpU表示水解后C的3'-羥基連有磷酸基，G的5'-羥基是游離的。而pApC↓pGpU則表示水解后C的3'-羥基是游離的，G的5'-羥基連有磷酸基。在不需要標(biāo)明核酸酶的水解部位時(shí)，上述簡(jiǎn)寫式中的p亦可省去，用連字符代替，如pA-C-G-U，或?qū)⑦B字符也省去，寫成pACGU。pACTG第38頁(yè)/共90頁(yè)核酸的序列測(cè)定開展較晚，20世紀(jì)70年代中期出現(xiàn)了快速測(cè)定DNA序列的新方法，1977年Sanger測(cè)定了ΦX174單鏈DNA5386b的全序列。隨后序列測(cè)定方法不斷改進(jìn)，現(xiàn)時(shí)DNA序列測(cè)定已走向自動(dòng)化，包括人類在內(nèi)的幾十個(gè)物種的DNA全序列測(cè)定已經(jīng)完成。由于DNA序列測(cè)定的原理與DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)，測(cè)序的基本原理將在本章最后一節(jié)簡(jiǎn)要介紹。第39頁(yè)/共90頁(yè)2.4DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA雙鏈的螺旋型空間結(jié)構(gòu)稱DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondarystructureofDNA)。1953年Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)(DNAdoublehelix,duplex)，是20世紀(jì)自然科學(xué)最重要的發(fā)現(xiàn)之一，對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展具有劃時(shí)代的意義。第40頁(yè)/共90頁(yè)2.4.1雙螺旋結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)X-射線衍射數(shù)據(jù)

Franklin和Wilkins發(fā)現(xiàn)不同來源的DNA纖維具有相似的X-射線衍射圖譜，而且延長(zhǎng)軸有0.34nm和3.4nm兩個(gè)重要的周期性變化，說明DNA可能有共同的空間結(jié)構(gòu)。X-射線衍射數(shù)據(jù)說明，DNA含有兩條或兩條以上具有螺旋結(jié)構(gòu)的多核苷酸鏈。用高度定向的DNA纖維得到的高質(zhì)量X-光衍射照片

第41頁(yè)/共90頁(yè)關(guān)于堿基成對(duì)的證據(jù)

Chargaff等應(yīng)用層析法對(duì)多種生物DNA的堿基組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DNA中腺嘌呤和胸腺嘧啶的數(shù)目基本相等，胞嘧啶(包括5-甲基胞嘧啶)和鳥嘌呤的數(shù)目基本相等，這一規(guī)律被稱作Chargaff規(guī)則(Chargaff’srules)。后來又有人證明腺嘌呤和胸腺嘧啶之間可以生成2個(gè)氫鍵，胞嘧啶和鳥嘌呤之間可以生成3個(gè)氫鍵。第42頁(yè)/共90頁(yè)第43頁(yè)/共90頁(yè)DNA的滴定曲線

從pH7用鹽酸滴定到pH2，用NaOH滴定到pH12，可得到圖2-15的曲線I。在pH4～11之間，只要加入少量的酸或堿，pH就發(fā)生明顯變化，說明這一pH區(qū)段無可滴定基團(tuán)，由于這一pH范圍是第二磷酸基的解離范圍，這一結(jié)果說明第二磷酸基處于結(jié)合狀態(tài)，表明核苷酸之間是通過磷酸二酯鍵連接的。在pH小于4.5時(shí)，加入一定量的酸不會(huì)引起pH的明顯變化，這是堿基的N原子結(jié)合H+的結(jié)果，當(dāng)pH大于11時(shí)，加入一定量的堿，不會(huì)引起pH值的明顯變化，這是堿基烯醇式羥基解離的結(jié)果。在pH4～11之間，堿基的可解離基團(tuán)不可滴定，一個(gè)合理的解釋是DNA形成雙鏈，有關(guān)基團(tuán)參與了氫鍵的形成。若分別從pH2和pH12將DNA溶液滴定到pH7，可得圖中的曲線II，非緩沖區(qū)在pH6～9之間，說明只有當(dāng)pH大于6和小于9時(shí)，單鏈的DNA才能形成雙鏈。第44頁(yè)/共90頁(yè)*

1953年Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，從此，核酸的研究成了生命科學(xué)中最活躍的領(lǐng)域之一。第45頁(yè)/共90頁(yè)DNA結(jié)構(gòu)：1962生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)：1962化學(xué)獎(jiǎng)第46頁(yè)/共90頁(yè)2.4.2DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)

(1)DNA分子由兩條方向相反的平行多核苷酸鏈構(gòu)成，一條鏈的5'-末端與另一條鏈的3'-末端相對(duì)，兩條鏈的糖-磷酸交替排列形成的主鏈沿共同的螺旋軸扭曲成右手螺旋(圖2-16)。第47頁(yè)/共90頁(yè)

(2)兩條鏈上的堿基均在主鏈內(nèi)側(cè)，一條鏈上的A一定與另一條鏈上的T配對(duì)，G一定與C配對(duì)。根據(jù)分子模型計(jì)算，一條鏈上的嘌呤堿必須與另一條鏈上的嘧啶堿相匹配，其距離才正好與雙螺旋的直徑相吻合。根據(jù)堿基構(gòu)象研究的結(jié)果，A與T配對(duì)形成2個(gè)氫鍵，G與C配對(duì)形成3個(gè)氫鍵(圖2-17)。由于堿基對(duì)的大小基本相同，所以無論堿基序列如何，雙螺旋DNA分子整個(gè)長(zhǎng)度的直徑相同，螺旋直徑為2nm。第48頁(yè)/共90頁(yè)堿基之間的配對(duì)關(guān)系稱堿基配對(duì)(basepairing)，根據(jù)堿基配對(duì)的原則，在一條鏈的堿基序列被確定后，另一條鏈必然有相對(duì)應(yīng)的堿基序列。如果DNA的兩條鏈分開，任何一條鏈都能夠按堿基配對(duì)的規(guī)律合成與之互補(bǔ)的另一條鏈。即由一個(gè)親代DNA分子合成兩個(gè)與親代DNA完全相同的子代分子。事實(shí)上，Watson和Crick在提出雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)，已經(jīng)考慮到DNA復(fù)制問題，并很快提出了半保留復(fù)制假說。第49頁(yè)/共90頁(yè)

(3)成對(duì)堿基大致處于同一平面，該平面與螺旋軸基本垂直。糖環(huán)平面與螺旋軸基本平行，磷酸基連在糖環(huán)的外側(cè)。相鄰堿基對(duì)平面間的距離為0.34nm，該距離使堿基平面間的π電子云可在一定程度上互相交蓋，形成堿基堆積力(basestackingforce)。雙螺旋每轉(zhuǎn)一周有10個(gè)堿基對(duì)，每轉(zhuǎn)的高度(螺距)為3.4nm(圖2-18)。DNA分子的大小常用堿基對(duì)數(shù)(basepair,bp)表示，而單鏈分子的大小則常用堿基數(shù)(base,b)，或核苷酸數(shù)(nucleotide,nt)來表示。第50頁(yè)/共90頁(yè)由于雙螺旋每轉(zhuǎn)一周有10個(gè)堿基對(duì)，相鄰堿基平面之間會(huì)繞著雙螺旋的螺旋軸旋轉(zhuǎn)36o，或者說，堿基平面之間有36o的錯(cuò)位，這不利于形成堿基堆積力。對(duì)DNA空間結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成堿基對(duì)的兩個(gè)堿基平面之間有圖2-19所示的螺旋槳式的扭曲(propellertwisting)，這種扭曲可以使相鄰堿基平面之間的重疊面增加，有利于提高分子的堿基堆積力。第51頁(yè)/共90頁(yè)HelicaltwistandpropellertwistinDNA.(a)SuccessivebasepairsinB-DNAshowarotationwithrespecttoeachother(so-calledhelicaltwist)of36°orso,asvieweddownthecylindricalaxisoftheDNA.(b)Rotationinadifferentdimension—propellortwist—allowsthehydrophobicsurfacesofbasestooverlapbetter.Theviewhereisedge-ontotwosuccessivebasesinoneDNAstrand(asifthetwobasesontheright-handstrandofDNAin(a)wereviewedfromtheright-handmarginofthepage;dotsrepresentend-onviewsdowntheglycosidicbonds).Clockwiserotation(asshownhere)hasapositivesign.(c)Thetwobasesontheleft-handstrandofDNAin(a)alsoshowpositivepropellortwist(aclockwiserotationofthetwobasesin(a)asviewedfromtheleft-handmarginofthepaper).第52頁(yè)/共90頁(yè)

(4)由于堿基對(duì)的糖苷鍵有一定的鍵角，使兩個(gè)糖苷鍵之間的窄角為120o，廣角為240o。堿基對(duì)因而向兩條主鏈的一側(cè)突出，堿基對(duì)上下堆積起來，窄角的一側(cè)形成小溝(minorgroove)，其寬度為1.2nm。廣角的一側(cè)形成大溝(majorgroove),其寬度為2.2nm。因此，DNA雙螺旋的表面可看到一條連續(xù)的大溝，和一條連續(xù)的小溝(圖2-20)。大溝和小溝可以特異性地與蛋白質(zhì)相互作用。特別是在大溝處，A-T，T-A，G-C和C-G的有關(guān)基團(tuán)分布各不相同，可以提供與蛋白質(zhì)相互識(shí)別的豐富信息。第53頁(yè)/共90頁(yè)Watson–CrickA:TandG:Cbasepairs.AllHbondsinbothbasepairsarestraight,witheachHatompointingdirectlyatitsacceptorNorOatom.LinearHbondsarethestrongest.Themandatorybindingoflargerpurineswithsmallerpyrimidinesleadstobasepairsthathavevirtuallyidenticaldimensions,allowingthetwosugar–phosphatebackbonestoadoptidenticalhelicalconformations.第54頁(yè)/共90頁(yè)

(5)大多數(shù)天然DNA屬雙鏈DNA(double-strandedDNA,dsDNA)，某些病毒如ΦX174和M13的DNA為單鏈DNA(single-strandedDNA,ssDNA)。

(6)雙鏈DNA分子主鏈上的化學(xué)鍵受堿基配對(duì)等因素影響旋轉(zhuǎn)受到限制，使DNA分子比較剛硬，呈比較伸展的結(jié)構(gòu)。但一些化學(xué)鏈亦可在一定范圍內(nèi)旋轉(zhuǎn)，使DNA分子有一定的柔韌性。按照Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，相鄰堿基平面之間會(huì)旋轉(zhuǎn)36o的角度，但Dickerson等研究人工合成的12bpDNA的空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)相鄰堿基平面之間的旋轉(zhuǎn)角度可在28o～42o的之間變動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，雙螺旋結(jié)構(gòu)可以發(fā)生一定的變化而形成不同的類型，亦可進(jìn)一步扭曲成三級(jí)結(jié)構(gòu)。第55頁(yè)/共90頁(yè)2.4.3DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的其它類型

Watson和Crick依據(jù)相對(duì)濕度92%的DNA鈉鹽所得到的X射線衍射圖提出的雙螺旋結(jié)構(gòu)稱B-DNA(BformDNA)，細(xì)胞內(nèi)的DNA與B-DNA非常相似。相對(duì)濕度為75%的DNA鈉鹽結(jié)構(gòu)有所不同，稱A-DNA(AformDNA)，A-DNA的堿基平面傾斜了20o，螺距和每一轉(zhuǎn)的堿基對(duì)數(shù)目變化如表2-2所示。A-DNA與RNA分子中的雙螺旋區(qū)，以及DNA-RNA雜合雙鏈分子在溶液中的構(gòu)象很接近，因此推測(cè)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，DNA分子發(fā)生B-DNA→A-DNA的轉(zhuǎn)變。在A-DNA和B-DNA中堿基均以反式構(gòu)象存在，但二者的糖環(huán)構(gòu)象不同，B-DNA為C-2'-endo構(gòu)象，而A-DNA為C-3'-endo構(gòu)象。A-DNA的堿基平面因此而傾斜了20°，同時(shí)，分子表面的大溝變得狹而深，小溝變得寬而淺。第56頁(yè)/共90頁(yè)

1979年底R(shí)ich等將人工合成的DNA片段d(CpGpCpGpCpGp)制成晶體，并進(jìn)行了X射線衍射分析(分辨是0.09nm)，證明此片段糖-磷酸主鏈形成鋸齒形(zig-zag)的左手螺旋，命名為Z-DNA(ZformDNA)。Z-DNA直徑約1.8nm，螺旋的每轉(zhuǎn)含12個(gè)堿基對(duì)，整個(gè)分子比較細(xì)長(zhǎng)而伸展，其堿基對(duì)偏離中心軸，靠近螺旋外側(cè)，螺旋的表面只有小溝沒有大溝。在Z-DNA中，嘌呤核苷酸的糖環(huán)為C-3'-endo構(gòu)象，嘧啶核苷酸的糖環(huán)為C-2'-endo構(gòu)象，嘌呤核苷酸為順式構(gòu)象，嘧啶核苷酸為反式構(gòu)象。Rich等還發(fā)現(xiàn)用熒光化合物標(biāo)記Z-DNA特異性抗體與果蠅唾液腺染色體的許多部位結(jié)合，在鼠類和各種植物的完整細(xì)胞核等自然體系中也找到了含有Z-DNA的區(qū)域。說明在天然DNA中確有Z-DNA

，且執(zhí)行著某種細(xì)胞功能。在接近生理?xiàng)l件的鹽濃度時(shí)，甲基化的d(GC)n可以從B型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)閆型結(jié)構(gòu)。已知當(dāng)雙螺旋DNA處于高度甲基化的狀態(tài)時(shí)，基因表達(dá)一般受到抑制，反之則得到加強(qiáng)，說明B-DNA與Z-DNA的相互轉(zhuǎn)換可能和基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。第57頁(yè)/共90頁(yè)ComparisonofthedeoxyguanosineconformationinB-andZ-DNA.InB-DNA,theCl'–N-9glycosylbondisalwaysintheantiposition(left).Incontrast,inthelefthandedZ-DNAstructure,thisbondrotates(asshown)toadoptthesynconformation.第58頁(yè)/共90頁(yè)Z-DNA存在的條件：

（1）高鹽：NaCl>2Mol/L,MgCl2>0.7Mol/L

（2）Pu,Py相間排列。（3）在活細(xì)胞中如果有m5C，則無需嘌呤-嘧啶相間排列，在生理鹽水的濃度下可產(chǎn)生Z型將結(jié)構(gòu)。（4）在體內(nèi)多胺化合物，如精胺和亞胺及亞精胺等陽(yáng)離子，可和磷酸基因結(jié)合，使B-DNA轉(zhuǎn)變成Z-DNA。（5）某些蛋白質(zhì)如Z-DNA結(jié)合蛋白帶有正電荷，可使DNA周圍形成局部的高鹽濃度微環(huán)境。（6）負(fù)超螺旋的存在。第59頁(yè)/共90頁(yè)Z-DNA的生物學(xué)意義

(1)可能提供某些調(diào)節(jié)蛋白的識(shí)別位點(diǎn)。嚙齒類動(dòng)物病毒的復(fù)制起始部位有d（GC）有交替順序的存在；在SV40的增強(qiáng)子中有三段8bp的Z-DNA存在。

(2)原生動(dòng)物纖毛蟲，有大、小兩個(gè)核，大核有轉(zhuǎn)錄活性，小核與繁殖有關(guān)。Z-DNA抗體以螢光標(biāo)記后，顯示僅和大核DNA結(jié)合，而不和小核的DNA結(jié)合，說明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。（3）DNA的甲基化與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)，一定程度的甲基化可以促進(jìn)Z-DNA的生成，說明Z-DNA與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。第60頁(yè)/共90頁(yè)第61頁(yè)/共90頁(yè)ComparisonoftheA-,B-,andZ-formsoftheDNAdoublehelix.ThedistancerequiredtocompleteonehelicalturnisshorterinA-DNAthanitisinB-DNA.Thealternatingpyrimidine–purinesequenceofZ-DNAisthekeytothe“l(fā)eft-handedness”ofthishelix.第62頁(yè)/共90頁(yè)

螺距殘基數(shù)堿基傾斜

A型(75%,Na)2.81120°B型(92%,Na)3.4100°C型(66%,Li)3.19.36°D/Rhybrid2.81120°Z型4.6129°第63頁(yè)/共90頁(yè)

DNA中存在不少如圖2-23所示的二重對(duì)稱結(jié)構(gòu)(twofoldrotationallysymmetry)，即一條鏈堿基序列的正讀與另一條鏈堿基序列的反讀是相同的。這種序列也可稱作反向重復(fù)順序(invertrepeatsequence)或者回文順序(palindromesequence)，這樣的序列很容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或十字架結(jié)構(gòu)。有些回文順序可以作為限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，還有些回文順序形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)錄的終止，或轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。鳥啼正落花花落正啼鳥第64頁(yè)/共90頁(yè)Hairpinsandcruciforms.PalindromicDNA(orRNA)sequencescanformalternativestructureswithintrastrandbasepairing.(a)WhenonlyasingleDNA(orRNA)strandisinvolved,thestructureiscalledahairpin.(b)WhenbothstrandsofaduplexDNAareinvolved,itiscalledacruciform.Blueshadinghighlightsasymmetricsequencesthatcanpairwiththecomplementarysequenceeitherinthesamestrandorinthecomplementarystrand.第65頁(yè)/共90頁(yè)

DNA的鏡像重復(fù)(mirrorrepeat)可能形成三螺旋DNA(triple-helicalDNA)的結(jié)構(gòu)(圖2-24)。在三螺旋結(jié)構(gòu)中，存在T-A*T，C-G*C+，T-A*A和C-G*G四種三聯(lián)堿基配對(duì)(圖2-25)，其中的“-”表示W(wǎng)otson-Crick堿基對(duì)，“*”表示Hoobsteen堿基配對(duì)，這種堿基配對(duì)是Hoobsteen于1963年首先發(fā)現(xiàn)的，因此而得名。C+表示質(zhì)子化的C，由于DNA的三螺旋結(jié)構(gòu)中存在C+，因此，也可被稱作H-DNA。第66頁(yè)/共90頁(yè)第67頁(yè)/共90頁(yè)原核生物基因組中不乏可形成三螺旋結(jié)構(gòu)的DNA序列。在細(xì)胞外，三螺旋結(jié)構(gòu)的形成需要酸性條件。但研究發(fā)現(xiàn)，多胺類（如精胺和亞精胺）在生理?xiàng)l件下可促進(jìn)三螺旋結(jié)構(gòu)的形成，其可能的原因是，多胺類降低了三條鏈的磷酸骨架之間的靜電斥力。利用抗三螺旋DNA的抗體發(fā)現(xiàn)，真核生物的染色體中確實(shí)存在三螺旋DNA。研究發(fā)現(xiàn)，三螺旋結(jié)構(gòu)可阻止DNA的體外合成。一種假設(shè)的可能的機(jī)制是，當(dāng)DNA聚合酶到達(dá)鏡像重復(fù)序列的中央時(shí)，模板會(huì)回折，與新合成的DNA形成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)，使DNA聚合酶無法沿模板鏈移動(dòng)，從而終止復(fù)制過程。細(xì)胞內(nèi)是否存在這樣的機(jī)制，有待實(shí)驗(yàn)工作來證實(shí)。第68頁(yè)/共90頁(yè)

DNA的某些特殊序列還可形成四鏈結(jié)構(gòu)(tetrasomystructure)，目前發(fā)現(xiàn)的四鏈結(jié)構(gòu)均是由串聯(lián)重復(fù)的鳥苷酸鏈構(gòu)成的。對(duì)四鏈結(jié)構(gòu)的X-射線衍射研究發(fā)現(xiàn)，四鏈結(jié)構(gòu)可以看成是由G-四聯(lián)體片層以螺旋方式堆積而成的。如圖2-26所示，4個(gè)G以Hoobsteen配對(duì)方式形成四聯(lián)體，中心的4個(gè)羰基氧原子形成一個(gè)負(fù)電微區(qū)，可以同陽(yáng)離子結(jié)合。G-四聯(lián)體中的每一個(gè)G分別來自4條多聚鳥苷酸鏈，G與戊糖形成的糖苷鍵為反式構(gòu)象。每個(gè)片層之間的旋轉(zhuǎn)角度為30o，可使螺旋軸延伸0.34nm。環(huán)境中的陽(yáng)離子可影響DNA四鏈結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象。第69頁(yè)/共90頁(yè)真核生物染色體的端粒DNA中有許多鳥苷酸的串聯(lián)重復(fù)，在一定的條件下，有可能形成四鏈DNA結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，在非變性電泳中，端粒DNA有很高的泳動(dòng)度，端粒DNA對(duì)水解單鏈核酸的酶有抗性，核磁共振和X-射線衍射研究發(fā)現(xiàn)，端粒DNA中存在G-G氫鍵，這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持端粒DNA中存在四鏈DNA結(jié)構(gòu)。除端粒DNA外，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)所對(duì)應(yīng)的DNA片段，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤敏感基因、tRNA基因和SupF基因的一些特殊序列，均存在串聯(lián)重復(fù)的鳥苷酸鏈，有可能形成四鏈DNA結(jié)構(gòu)。在酵母提取液中，發(fā)現(xiàn)了以四鏈DNA為底物的核酸酶，提示生物體內(nèi)可能有天然存在的四鏈DNA結(jié)構(gòu)。四鏈DNA結(jié)構(gòu)的生物學(xué)意義有待深入研究。第70頁(yè)/共90頁(yè)2.5DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)2.5.1環(huán)狀DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)細(xì)菌的染色體DNA，某些病毒的DNA，細(xì)菌質(zhì)粒、真核生物的線粒體和葉綠體的DNA，為雙鏈環(huán)狀DNA。在生物體內(nèi)，絕大多數(shù)雙鏈環(huán)狀DNA(double-strandcircularDNA,dcDNA)可進(jìn)一步扭曲成超螺旋DNA(superhelixDNA)，這種結(jié)構(gòu)還可被稱為共價(jià)閉環(huán)DNA(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)。超螺旋DNA具有更為致密的結(jié)構(gòu)，可以將很長(zhǎng)的DNA分子壓縮在一個(gè)較小的體積內(nèi)，同時(shí)，也增加了DNA的穩(wěn)定性。由于超螺旋DNA的密度較大，在離心場(chǎng)中和凝膠電泳中的移動(dòng)速度較線性DNA快。若超螺旋DNA的一條鏈斷裂，分子將釋放扭曲張力，形成松弛環(huán)狀DNA(relaxedcircularDNA)，也稱為開環(huán)DNA(opencircularDNA,ocDNA)。開環(huán)DNA在離心場(chǎng)中和凝膠電泳中的移動(dòng)速度較線性DNA慢。若超螺旋DNA的兩條鏈均斷裂，就會(huì)轉(zhuǎn)化為線性DNA(linearDNA)。第71頁(yè)/共90頁(yè)為了更好的描述超螺旋DNA，將DNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數(shù)定義為連環(huán)數(shù)(linkingnumber,L)，雙螺旋的圈數(shù)定義為扭轉(zhuǎn)數(shù)(twisingnumber,T)，超螺旋數(shù)定義為纏繞數(shù)(writhingnumber,W)。如圖2-27所示，一段雙螺旋圈數(shù)為40的B-DNA，在40轉(zhuǎn)螺旋均已形成的情況下連接成環(huán)形時(shí)，雙鏈環(huán)不發(fā)生進(jìn)一步扭曲，構(gòu)成松弛環(huán)形DNA，其L和T均為40，W為0。若在DNA旋轉(zhuǎn)酶(Gyrase)，即拓?fù)洚悩?gòu)酶II(TopII)的作用下，使上述環(huán)形DNA形成4周右手超螺旋，則連環(huán)數(shù)減少4周，即L為36，而雙螺旋的圈數(shù)，即T依然是40。將這種狀態(tài)下的超螺旋數(shù)規(guī)定為負(fù)值，即W為–4。即可得出下列關(guān)系式：L=T+W。這種在拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用下，通過減少連環(huán)數(shù)形成的超螺旋稱作負(fù)超螺旋DNA(negativesupercoilidDNA)。若在兩條鏈均不斷開的情況下解開負(fù)超螺旋，則雙螺旋的部分區(qū)域會(huì)形成單鏈區(qū)，在圖2-27的例子中，L和T均為36，W為0，依然滿足L=T+W的關(guān)系式，這種形式稱解鏈環(huán)形DNA。第72頁(yè)/共90頁(yè)White方程：L=T+W

L：連環(huán)數(shù)或稱拓?fù)洵h(huán)繞數(shù)，指cccDNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數(shù)。其特點(diǎn)是：(1)L是整數(shù)；(2)在cccDNA中任何拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài)中其值保持不變；（3）右手螺旋的L取正值。

W：扭曲數(shù)，即超螺旋數(shù)。其特點(diǎn)是：(1)可以是非整數(shù)；(2)是變量；(3)右手超螺旋的W取負(fù)值。

T：纏繞數(shù)，即雙螺旋的圈數(shù)。其特點(diǎn)是：(1)可以是非整數(shù)；(2)是變量；(3)右手螺旋時(shí)T為正值。

超螺旋的量度可以用超螺旋密度λ來表示：

λ=（L–T）/T

在天然DNA中，λ約為–0.05，大約20個(gè)雙螺旋有1個(gè)超螺旋。第73頁(yè)/共90頁(yè)

DNA兩條鏈的關(guān)系很像兩股扭在一起的蠅子，用具一定彈性的兩股繩子(如軟電線)可演示圖2-27所示的各種狀態(tài)。在環(huán)狀DNA的兩條鏈均不斷開的情況下，若雙螺旋進(jìn)一步解開，即會(huì)形成左手超螺旋，稱正超螺旋DNA(positivesupercoilidDNA)。超螺旋DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，兩條鏈要不斷解開，為防止正超螺旋的形成，可在拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用下，消除形成正超螺旋的扭曲張力。第74頁(yè)/共90頁(yè)負(fù)超螺旋

右手正超螺旋

左手

DNA雙螺旋為右手螺旋。細(xì)胞中的環(huán)狀DNA一般呈負(fù)超螺旋，即右手螺旋不足造成的扭曲張力，導(dǎo)致分子通過整體的右手超螺旋來補(bǔ)足右手雙螺旋，在數(shù)學(xué)上呈1：1，即分子整體右旋一圈來補(bǔ)雙螺旋上的一圈不足。正超螺旋為雙螺旋旋轉(zhuǎn)過度，通過分子整體的左旋來解開過度的螺旋。第75頁(yè)/共90頁(yè)SupercoiledDNAtopology.第76頁(yè)/共90頁(yè)

拓?fù)洚悩?gòu)酶II可以將DNA的兩條鏈切斷，使其中的一段DNA跨越另一段DNA后再連接。在消耗ATP的情況下，每作用一次可引入2個(gè)負(fù)超螺旋，使L減少2，W取值則為–2(圖2-28)。若將負(fù)超螺旋解開，則雙螺旋減少2周。在不消耗ATP的情況，該酶可消除負(fù)超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TopI)曾被稱作ω蛋白，松馳酶等，是Mr為1.1×105的一條肽鏈，由top基因編碼。其作用機(jī)制是切開DNA雙鏈中的一條鏈，繞另一條鏈一周后再連接，可以改變DNA的連環(huán)數(shù)，從而改變超螺旋的圈數(shù)。TopI可消除和減少負(fù)超螺旋，對(duì)正超螺旋不起作用，其作用過程不需要ATP提供能量。第77頁(yè)/共90頁(yè)Visualizationoftopoisomers.Inthisexperiment,allDNAmoleculeshavethesamenumberofbasepairsbutexhibitsomerangeinthedegreeofsupercoiling.BecausesupercoiledDNAmoleculesaremorecompactthanrelaxedmolecules,theymigratemorerapidlyduringgelelectrophoresis.Thegelsshownhereseparatetopoisomers(movingfromtoptobottom)overalimitedrangeofsuperhelicaldensity.Inlane1,highlysupercoiledDNAmigratesinasingleband,eventhoughdifferenttopoisomersareprobablypresent.Lanes2and3illustratetheeffectoftreatingthesupercoiledDNAwithatypeItopoisomerase;theDNAinlane3wastreatedforalongertimethanthatinlane2.AsthesuperhelicaldensityoftheDNAisreducedtothepointwhereitcorrespondstotherangeinwhichthegelcanresolveindividualtopoisomers,distinctbandsappear.Individualbandsintheregionindicatedbythebracketnexttolane3eachcontainDNAcircleswiththesamelinkingnumber;thelinkingnumberchangesby1fromonebandtothenext.第78頁(yè)/共90頁(yè)2.5.2真核生物染色體的結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的染色質(zhì)和一些病毒的DNA是雙螺旋線形分子，由于與組蛋白結(jié)合，其兩端不能自由轉(zhuǎn)動(dòng)。雙螺旋DNA分子先盤繞組蛋白形成核小體(nucleosome)，或稱核粒，許多核小體由DNA鏈連在一起構(gòu)成串珠狀結(jié)構(gòu)。每個(gè)核小體的直徑為11nm，它是由DNA分子在組蛋白核心外面纏繞約1.75圈(約146bp)構(gòu)成的。組蛋白(histone)因所含堿性氨基酸的比例不同，可用聚丙烯酰胺凝膠電泳分為H1，H2A，H2B，H3和H4五種。核小體的核心含H2A，H2B，H3和H4各兩分子，這4種組蛋白的C端富含疏水氨基酸，使各個(gè)亞基可以通過疏水作用相互結(jié)合，N端富含帶正電荷的堿性氨基酸，可以同帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合。這4種組蛋白沒有種屬和組織特異性，進(jìn)化上很保守。連接核粒核心的DNA片段稱間隔區(qū)，長(zhǎng)度一般為20～60bp，可結(jié)合一分子H1(圖2-29)，H1分子較大，有一定的種屬和組織特異性。組蛋白與DNA之間主要通過離子鍵和氫鍵結(jié)合，其相互作用是結(jié)構(gòu)性的，不依賴于核苷酸的特異序列。第79頁(yè)/共90頁(yè)核小體的電鏡照片ElectronmicrographofDrosophilamelanogasterchromatinafterswellingrevealsthepresenceofnucleosomesas“beadsonastring.”第80頁(yè)/共90頁(yè)

DNA分子纏繞組蛋白核心時(shí)，也會(huì)發(fā)生拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化，其原理如圖2-30所示。因此，纏繞在組蛋白核心DNA分子也是一種超螺旋結(jié)構(gòu)。第81頁(yè)/共90頁(yè)組蛋白八聚體：（a)前面觀；(b)頂面觀；（c）沿著染色體纖維長(zhǎng)軸的透視圖；(d)DNA與組蛋白空間結(jié)構(gòu)的模式圖。FourorthogonalviewsofthehistoneoctamerasdeterminedbyX-raycrystallography:(a)frontview;(b)topview;and(c)diskview,thatis,asvieweddownthelongaxisofthechromatinfiber.Inthe(c)perspective,theDNAduplexwouldwraparoundtheoctamer,withtheaxisoftheDNAsupercoilperpendiculartotheplaneofthepicture.(d)SuggestedappearanceofthenucleosomewhenwrappedwithDNA.第82頁(yè)/共90頁(yè)（a)核小體的結(jié)構(gòu)圖，左圖為沿核小體軸觀察的圖示；右圖為沿核小體軸垂直方向觀察的圖示；(b)一半核小體的結(jié)構(gòu)圖。(a)Deduce