流式細胞儀的熒光補償問題

流式細胞儀的熒光補償問題第1頁/共24頁1.熒光素為什么會出現(xiàn)熒光？2.檢測前為什么需要進行熒光補償？3.熒光補償?shù)姆椒ㄓ心男?.熒光補償?shù)脑瓌t是什么？第2頁/共24頁熒光發(fā)生的機理

室溫下熒光素分子大部分處于“基態(tài)”，當熒光素在一定波長（激發(fā)波長）的光的照射下吸收光能后（經(jīng)染色后的細胞在激光束的照射下），熒光染料吸收能量能級躍遷，進入新的狀態(tài)，稱為“激發(fā)態(tài)”，處于激發(fā)態(tài)的分子極不穩(wěn)定，它可以通過在10-9－10-7秒的極短時間內(nèi)以發(fā)射一定波長的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光。第3頁/共24頁第4頁/共24頁熒光素的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何發(fā)熒光的物質(zhì)分子都具有這兩個特征光譜激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission）：是指某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光。發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長）：Em-Max第5頁/共24頁發(fā)射波峰--最大發(fā)射波長FITC--異硫氰酸熒光素第6頁/共24頁PE--藻紅蛋白第7頁/共24頁PE-Cy5--藻紅蛋白偶聯(lián)物第8頁/共24頁熒光染色對照的設(shè)置陰性對照空白對照（自發(fā)熒光）同型（ISO)對照（自發(fā)熒光＋非特異熒光）實驗樣本（特異熒光＋自發(fā)熒光＋非特異熒光）第9頁/共24頁熒光染料平均熒光強度比較

PerCP<APC<FITC<ECD<PC5<PE第10頁/共24頁同型對照的選擇與實驗染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型；與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標記④相同劑量和濃度第11頁/共24頁分析類型管功能

加入的抗體單色分析1Isotypeγ1-FITC2Sample1,2……A-FITC雙色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE三色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PC55Sample1,2……A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-ECDγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-ECDγ1-PC55Compensation4γ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDD-PC56Sample1,2……A-FITCB-PEC-ECDD-PC5第12頁/共24頁熒光補償（compensation）定義：指在流式細胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊（spectraloverlap）的過程，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號。

第13頁/共24頁補償方法手動補償自動補償（flow-set)無論手動或自動補償都需將單種熒光素標記的單克隆抗體分別進行單色熒光染色※即幾色分析就需要制備幾個補償對照管第14頁/共24頁現(xiàn)舉例進行FITC、PE、PC5三色手動補償1.準備ISO（陰性對照管）；

IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PC52.通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性群體落在雙陰性區(qū)域；

FITC與PE、FITC與PC5、PE與PC5第15頁/共24頁第16頁/共24頁FITCFITC與PEPE第17頁/共24頁3.上單染管(CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE)，準備補償；（注：保持電壓絕對不變；開始補償前，將原補償全部歸零；）第18頁/共24頁調(diào)節(jié)補償原則橫平豎直即X-mean或Y-mean相等第19頁/共24頁雙色熒光補償1第20頁/共24頁雙色熒光補償2

第21頁/共24頁第22頁/共24頁雙陰雙陽單陽CD