流式細(xì)胞術(shù)在科研中的應(yīng)用描述

流式細(xì)胞術(shù)在科研中的應(yīng)用描述第1頁/共55頁

流式細(xì)胞術(shù)在科研中的應(yīng)用

第2頁/共55頁什么是流式細(xì)胞儀●流式細(xì)胞儀實物BDFACSVantageBD-Calibur第3頁/共55頁流式細(xì)胞儀可檢測到的細(xì)胞參數(shù)

非熒光信號顆粒度細(xì)胞大小前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性第4頁/共55頁外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點圖第5頁/共55頁熒光信號熒光強度（FL）：細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來（強弱）一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細(xì)胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。第6頁/共55頁熒光信號雙色直接染色第7頁/共55頁流式報告的圖一般分為四種，即散點圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點圖和直方圖。幾個概念：%Gated：陽性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽性細(xì)胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強度，與被檢測物質(zhì)的表達(dá)量有關(guān)，在正態(tài)分布時一般用該值。GeoMean：幾何平均熒光強度，在陽性細(xì)胞為偏態(tài)分布時一般用該值。第8頁/共55頁散點圖

密度圖二維等高圖直方圖圖報告中常見的幾種流式細(xì)胞圖第9頁/共55頁圖AnnexinV/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死第10頁/共55頁流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析點圖分析第11頁/共55頁流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析直方圖分析第12頁/共55頁圖中100～101（M1）為陰性細(xì)胞，101以上的（M2）為陽性細(xì)胞第13頁/共55頁當(dāng)前流式細(xì)胞分析發(fā)展趨勢從相對細(xì)胞計數(shù)到絕對細(xì)胞計數(shù)從相對定量到絕對定量分析從單色到多色熒光分析從細(xì)胞膜成分到細(xì)胞內(nèi)成分分析從細(xì)胞分析到可溶性成分的流式細(xì)胞分析第14頁/共55頁今天主要內(nèi)容：流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞凋亡檢測中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤細(xì)胞DNA倍體中的應(yīng)用流式細(xì)胞儀的分選功能流式細(xì)胞術(shù)在蛋白檢測中的應(yīng)用第15頁/共55頁細(xì)胞凋亡檢測第16頁/共55頁1、半胱氨酸蛋白酶3檢測法（早早期）2、AnnexinV-FITC/PI法（早期）3、Apo2.7檢測法（早期）4、TUNEL法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的流式細(xì)胞術(shù)檢測流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡第17頁/共55頁細(xì)胞凋亡的分析細(xì)胞凋亡的主要表現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)水解酶改變：如Caspase-3活化細(xì)胞膜不對稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI細(xì)胞核DNA的斷裂改變：TUNNEL實驗（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相關(guān)蛋白：FasBcl-2第18頁/共55頁細(xì)胞凋亡——ActiveCaspases-3第19頁/共55頁細(xì)胞凋亡——Caspases-3第20頁/共55頁細(xì)胞凋亡——AnnexinⅤ第21頁/共55頁凋亡檢測（AnnexinV/PI法）

PIAnnexinV-FITC第22頁/共55頁DNA倍體的流式分析第23頁/共55頁細(xì)胞DNA含量檢測細(xì)胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個原理，可測出細(xì)胞的DNA含量。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測。

第24頁/共55頁第25頁/共55頁單參數(shù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細(xì)胞，4N代表G2/M期細(xì)胞，兩者中間代表S期細(xì)胞。這是以2倍體和4倍體細(xì)胞為主的流式DNA圖第26頁/共55頁DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細(xì)胞數(shù)量2N4N

第27頁/共55頁第28頁/共55頁2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體第29頁/共55頁含量與凋亡關(guān)系DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標(biāo)本制備中的固定處理時，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。第30頁/共55頁第31頁/共55頁第32頁/共55頁Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48

圖FCM測試細(xì)胞周期分布和凋亡第33頁/共55頁流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選功能第34頁/共55頁分選：用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細(xì)胞，大型機分選速度可達(dá)到每秒上萬個細(xì)胞第35頁/共55頁488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第36頁/共55頁流式分選與分子生物學(xué)研究除了將分選得到的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)研究外，F(xiàn)CM分選系統(tǒng)可為PCR、FISH等分子技術(shù)提供純度較高的特異性細(xì)胞群，減少研究中的干擾因素，獲得更準(zhǔn)確的實驗結(jié)果。第37頁/共55頁CytometricBeadsArray(CBA)

流式液相多重蛋白

定量技術(shù)第38頁/共55頁導(dǎo)言常規(guī)的蛋白分析方法：ELISA：一次反應(yīng)只能檢測一個指標(biāo)Westernblot：不能對蛋白精確定量不足之處：檢測多個指標(biāo)需耗費大量樣本分批操作導(dǎo)致組間差異大操作繁瑣，耗時耗力如何能夠從單個微量樣本中一次檢測多個目標(biāo)蛋白，并加以定量，獲得高精確度的數(shù)據(jù)呢？針對于此，BD-Pharmingen成功研發(fā)了基于流式細(xì)胞儀檢測平臺的液相多重蛋白定量技術(shù)——BDCytometricBeadArray，簡稱CBA

第39頁/共55頁CBA技術(shù)簡介CBA是一系列帶有不同強度紅色熒光、包被有捕獲抗體的微球，類似ELISA的捕獲孔板，可以捕獲液相樣本（血清、血漿或者細(xì)胞培養(yǎng)上清液等）中相應(yīng)的抗原，再結(jié)合PE標(biāo)記檢測抗體，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測，便可同時對樣本中的多種可溶性蛋白成分進(jìn)行定量++AnalyteofinterestFluorescentdetectionAb

captureBead

captureAbBead第40頁/共55頁BDCytometricBeadArray123不同強度紅色熒光的捕獲微球，在FCMFL3檢測不同的目標(biāo)蛋白PE標(biāo)記的檢測抗體，在FCMFL2檢測。PE的熒光強度即反映靶蛋白的含量456第41頁/共55頁HumanTh1/Th2LymphokineCBATh1/Th2panel:IL2,IL4,IL5,IL10,TNF,IFN用

FL3熒光的強度不同區(qū)別種不同的微球（beads）DirectsandwichimmunoassayFL2(PE)detectorreagent樣本處理6cytokinesfroma50Lsample

Threepipettingsteps 3hourtotalincubation QuantitativeresultsandcompletereportgenerationSoftwareassistedquantitativeanalysis,withcurvefittingalgorithmResultreportingincludedinsoftware第42頁/共55頁HumanTh1/Th2LymphokineCBA第43頁/共55頁

Chemokine-ICBAAssayStandard0pg/mlCBAAssayStandard第44頁/共55頁10pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第45頁/共55頁20pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第46頁/共55頁40pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第47頁/共55頁80pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第48頁/共55頁156pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第49頁/共55頁312pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第50頁/共55頁625pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第51頁/共55頁1250pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第52頁/共55頁2500pg/mlCBAAssayStandardcont.Che