流式細(xì)胞術(shù)的原理與應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)的原理與應(yīng)用第1頁/共39頁一簡介

流式細(xì)胞儀(FlowCytometer):是集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM):利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)。第2頁/共39頁流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)單個(gè)細(xì)胞或微粒分析同時(shí)多參數(shù)分析速度快：10000個(gè)細(xì)胞(微粒)/秒統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細(xì)胞或微粒第3頁/共39頁舉例：細(xì)胞周期分布檢測第4頁/共39頁流路(液流系統(tǒng)）流動(dòng)室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細(xì)胞懸液5*105~1*106個(gè)/ml光路（光學(xué)系統(tǒng)）光源濾片電路（檢測系統(tǒng)）光電倍增管PMT放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計(jì)（分析系統(tǒng)）計(jì)算機(jī)二構(gòu)造及工作原理第5頁/共39頁

流動(dòng)室是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。流動(dòng)室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開一個(gè)孔徑為430μm×180μm的長方形孔，供細(xì)胞單個(gè)流過，檢測區(qū)在該孔的中心，這種流動(dòng)室的光學(xué)特性良好，流速較慢，因而細(xì)胞受照時(shí)間長，可收集的細(xì)胞信號(hào)光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。液流系統(tǒng)第6頁/共39頁流動(dòng)室InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系統(tǒng)第7頁/共39頁激光光源：目前臺(tái)式機(jī)FCM，大多采用氬離子氣體激光器。激光(laser)是—種相干光源，它能提供單波長、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源。由于細(xì)胞快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為1μs左右，每個(gè)細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞需要足夠的光照強(qiáng)度。

光學(xué)系統(tǒng)第8頁/共39頁信號(hào)散射光信號(hào)

FS細(xì)胞大小

SS細(xì)胞顆粒性熒光信號(hào)

FL1–FITC

FL2–PE

FL3–ECD

FL4–PC5光學(xué)系統(tǒng)第9頁/共39頁散射光信號(hào)——

細(xì)胞大小及顆粒性FSSS光學(xué)系統(tǒng)第10頁/共39頁光路（濾片特性）光學(xué)系統(tǒng)第11頁/共39頁流式細(xì)胞儀光路圖Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BP

FL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL光學(xué)系統(tǒng)第12頁/共39頁電路電壓調(diào)節(jié)光電倍增管電壓volts增益Gain信號(hào)放大方式檢測系統(tǒng)第13頁/共39頁電信號(hào)輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對(duì)數(shù)放大。細(xì)胞DNA含量、RNA含量等的測量一般選用線性放大測量。在細(xì)胞膜表面抗原等的檢測時(shí)，細(xì)胞膜表面抗原的分布有時(shí)要相差幾十倍，甚至幾萬倍，通常使用對(duì)數(shù)放大器。

檢測系統(tǒng)第14頁/共39頁常用熒光染料介紹FITC：綠色525nmPE：橙黃色575nmECD：橙紅色610nmPE－CY5：深紅色675nmPerCP：深紅色675nmPE－CY7：深紅色755nm7AAD：深紅色675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發(fā)第15頁/共39頁光路補(bǔ)償

FITC/PE/ECD/PC5第16頁/共39頁三FCM的數(shù)據(jù)分析單參數(shù)一維直方圖縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)，橫坐標(biāo)表示相對(duì)熒光信號(hào)或散色光信號(hào)值，單位是道數(shù)。第17頁/共39頁2.雙參數(shù)二維點(diǎn)圖顯示來自同一細(xì)胞的兩個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量間的關(guān)系。橫、縱坐標(biāo)分別表示兩個(gè)參數(shù)的相對(duì)含量。通過分別計(jì)算兩坐標(biāo)所表示參數(shù)的陽性率來得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第18頁/共39頁3.等高線圖4.密度圖第19頁/共39頁白血病免疫分型HLA-B27:強(qiáng)直性脊柱炎淋巴細(xì)胞亞群造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)：造血干細(xì)胞移植網(wǎng)織紅細(xì)胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗(yàn)1流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用四FCM的應(yīng)用第20頁/共39頁細(xì)胞大小細(xì)胞的顆粒度細(xì)胞表面分子：CD系列細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞核內(nèi)分子：P53細(xì)胞功能檢測：細(xì)胞周期、凋亡2流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用第21頁/共39頁熒光信號(hào)的定量可以用平均熒光強(qiáng)度（mean值），熒光信號(hào)面積（Area，A）來表示。1）蛋白表達(dá)的檢測第22頁/共39頁2）DNAAnalysisPIEthidiumBromideAcridineOrangeDAPI(UVexcitable)Hoechst33342(viable,UVexcitable)不能主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞，需要固定打孔488nm激發(fā)為脂溶性，主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞UV激發(fā)常用的DNA染料第23頁/共39頁02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisCount2N4NG2MG0G1s第24頁/共39頁02004006008001000PIFluorescence2N4NDNAAnalysis第25頁/共39頁3）Apoptosis檢測第26頁/共39頁A）DNA片斷化檢測細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長的DNA大片段,或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段第27頁/共39頁B）Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。第28頁/共39頁C）AnnexinVAssay磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中,Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合第29頁/共39頁AnnexinVAssay能夠區(qū)分死亡與凋亡第30頁/共39頁D）TUNEL

細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）

第31頁/共39頁五實(shí)例第3