組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第1頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二消毒和滅菌物理消毒化學(xué)消毒抗生素消毒

第2頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二1.紫外線消毒紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。紫外線的直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡單，效果好。紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強(qiáng)度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強(qiáng)度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時(shí)間呈正比。紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，且對培養(yǎng)細(xì)胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開著紫外等操作。物理消毒第3頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二2.高溫濕熱滅菌

壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。不同壓力蒸汽所達(dá)到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時(shí)間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體），應(yīng)立即放到60-70℃烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。物理消毒第4頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二3.高溫干熱滅菌干熱滅菌主要是將電熱烤箱內(nèi)物品加熱到160℃以上，并保持90-120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶）、金屬器皿。干熱滅菌后要關(guān)掉開關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開，切忌立即打開，以免溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。干烤箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺面上的酒精燈的火焰對金屬器皿及玻璃器皿口緣進(jìn)行燒灼消毒。物理消毒第5頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二4.過濾除菌

是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。在體外培養(yǎng)時(shí)，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。物理消毒第6頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二

新潔而滅，其0.1％水溶液可對器械、皮膚、操作表面進(jìn)行擦拭和浸泡消毒?；瘜W(xué)消毒第7頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二抗生素消毒抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。用的過濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實(shí)驗(yàn)室空氣；多用新潔而滅消毒實(shí)驗(yàn)室地面；常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養(yǎng)用器皿；采用高壓蒸汽滅菌或過濾除菌方法消毒培養(yǎng)液。第8頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二第三章細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境，用于維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細(xì)胞用的物質(zhì)，使細(xì)胞在此環(huán)境中有生長和繁殖的能力。

細(xì)胞培養(yǎng)基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子及其他一些入核酸降解物、激素等。第9頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二水與平衡鹽溶液1.水

體外培養(yǎng)的細(xì)胞對水的純度要求較高。配制培養(yǎng)用液應(yīng)使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。存放時(shí)間一般不應(yīng)超過2周。2.緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液。第10頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

1.營養(yǎng)成分氨基酸：是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細(xì)胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細(xì)胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸。第11頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二2單糖：培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。第12頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二

3維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。4無機(jī)離子與微量元素：細(xì)胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。

第13頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

2.促生長因子及激素各種激素、生長因子對于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。

胰島素:它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。氫化可的松:可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長；

泌乳素:有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長作用等。

生長因子:bFGF、VEGF、EGF等。第14頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

3.滲透壓細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在260-320mOsm/kg的范圍都適宜。每公斤水中所含的毫滲透粒子數(shù)(mOsm/kgH2O)第15頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

4.pH值

pH值約在7.2-7.45.氣體

主要是O2和CO26.無毒、無污染

造成pH波動(dòng)主要是代謝產(chǎn)生的CO2，在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2

緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2

及時(shí)溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5％），與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。NaHCO3+H2O-----Na++OH-+H2O+CO2第16頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二天然細(xì)胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是必不可少。第17頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二血清血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物血清種類:主要是牛血清、人血清、馬血清等。牛血清分為小牛、新生牛和胎牛血清。

胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛；

小牛血清取自出生10－30天的小牛。第18頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二血清主要作用提供基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、核酸衍生物等。提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類固醇激素等。生長因子如bFGF、EGF等。提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等。提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：有一些細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。第19頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)血清含一些對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如補(bǔ)體、抗體素等都會(huì)影響細(xì)胞生長，甚至造成細(xì)胞死亡。動(dòng)物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。取材中可能帶入支原體、病毒，對細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響。血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源困難，價(jià)格昂貴。第20頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二血清質(zhì)量的鑒定理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。微生物檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。促生長效果：這是血清重要的特性之一，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測。有三種方法：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。第21頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二血清判斷好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠；發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性；血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象；搖晃時(shí)感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。

要進(jìn)一步了解血清的質(zhì)量，則應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)某些細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長狀況。第22頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二血清的使用和儲存使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。儲存條件：血清一般儲存于-20℃，同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融。使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5－20％，最常用是10％。采購血清時(shí)，最好先從供應(yīng)商處索取樣品進(jìn)行試驗(yàn)，選定一批后就要保留足夠使用6個(gè)月至1年的量。第23頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二合成細(xì)胞培養(yǎng)基一、基本組分

無機(jī)鹽

CaCl2MgSO4NaClNaHCO3NaH2PO4

氨基酸

維生素

脂溶性維生素(A、D、E、K)

水溶性維生素包括牛物素、葉酸、B12等。碳水化合物

主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。酚紅pH小于6.8呈黃色；pH大于8.4呈紅色第24頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生過量的乳酸，降低培養(yǎng)基pH值，增加滲透壓，減少乳酸生產(chǎn)最常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量。乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細(xì)胞生長以及產(chǎn)品質(zhì)量。氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產(chǎn)生的。限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。第25頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二常用細(xì)胞培養(yǎng)基MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列199細(xì)胞培養(yǎng)基系列水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列其它類型細(xì)胞培養(yǎng)基第26頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二第27頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二第28頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二第29頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二干粉培養(yǎng)基的配制認(rèn)真閱讀說明書。注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。配制所用的水應(yīng)是三蒸水。所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。第30頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二干粉培養(yǎng)基的配制方法在一個(gè)盡可能接近總體積的容器中加入比預(yù)期培養(yǎng)基總體積少5％的雙蒸水。在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。水洗包裝袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。加NaHCO3到培養(yǎng)基中。用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過分?jǐn)嚢?。通過緩慢攪拌加入1NNaOH或1NHCL調(diào)節(jié)pH值，培養(yǎng)基在過濾前要保持密封。第31頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二無血清技術(shù)及其培養(yǎng)基觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物；激素類藥物的研發(fā)。第32頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二無血清培養(yǎng)基的基本配方基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加組分促貼壁物質(zhì)促生長因子及激素酶抑制劑結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白微量元素

第33頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二使用方法細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。第34頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二使用方法為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是：處于對數(shù)生長中期>90%活細(xì)胞率適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種第35頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法1.直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中。對于直接適應(yīng)，接種密度該:2.5~3.5×105個(gè)/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1~3×106

個(gè)/ml時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4-7天后達(dá)到2~4×106

細(xì)胞/ml時(shí)，細(xì)胞完全適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基?？梢詡鞔囵B(yǎng)。第36頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法2.連續(xù)適應(yīng)以2倍正常接種密度接種生長活躍的細(xì)胞到75%血清培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度>5×105

細(xì)胞/ml時(shí)，以2-3×105

細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在血清培養(yǎng)基：SFM為1:1的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。以2-3×106

細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25％有血清培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1-3×106

細(xì)胞/ml，在100％SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。每隔3-5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1-3×106

細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時(shí)，再次傳代培養(yǎng)。第37頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二使用無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)增加確定性性能更加一致容易進(jìn)行純化和下游加工細(xì)胞功能的精確評估增強(qiáng)生長和/或產(chǎn)量生理反應(yīng)性的較好對照增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測第38頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二無蛋白培養(yǎng)基

無蛋白培養(yǎng)基即不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動(dòng)物蛋白。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢來看，不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基又廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)最終要應(yīng)用于人體，如果再生長過程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復(fù)雜，最終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度。無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢而出現(xiàn)的，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長因子的作用。市場上已有適合多種細(xì)胞生長的無蛋白培養(yǎng)基。第39頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二限定化學(xué)成分培養(yǎng)基

限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemicaldefinedmedium,CDM)是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動(dòng)物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長的CDM問世。第40頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二其他細(xì)胞培養(yǎng)用液平衡鹽溶液消化液pH調(diào)整液抗生素溶液谷氨酰胺補(bǔ)充液第41頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二平衡鹽溶液主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供營養(yǎng)。用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。D-Hank's與Hank's的一個(gè)主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Hank's平衡液僅含有0.35g/LNaHCO3，不能用于5%CO2的環(huán)境，若放入CO2培養(yǎng)相，溶液將迅速變酸，使用時(shí)應(yīng)注意。配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。第42頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二平衡鹽溶液配制圖第43頁，共48頁，2023年，2月20日，星期二消化液1.胰酶溶液：胰消化酪蛋白的能力常見有1：125和1：250。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH