組織培養(yǎng)與植物轉(zhuǎn)基因

組織培養(yǎng)與植物轉(zhuǎn)基因1第1頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物基因工程是80年代開始興起和發(fā)展起來的一門新技術(shù)，它是在分子遺傳學的理論基礎(chǔ)上，綜合采用了分子生物學、微生物學和植物組織培養(yǎng)的現(xiàn)代方法和技術(shù)建立起來的。轉(zhuǎn)移的目的基因可從動物、人、植物或微生物中獲取。植物基因工程首先是隨原核生物的基因工程的發(fā)展而得以發(fā)展。大腸桿菌，酵母，動植物細胞。2第2頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物基因工程發(fā)展迅速。自從1983年首例轉(zhuǎn)基因植物（煙草）誕生以來，現(xiàn)在已有100多種植物通過基因工程技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，包括番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯、胡蘿卜、芹菜、萵苣、甜瓜、黃瓜、白菜、甘藍、花椰菜、芥菜、石刁柏、洋蔥、柑橘、柿、楊樹、桉樹等。3第3頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二2植物基因工程的載體Ti—載體其它載體RNAi

4第4頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）的Ti質(zhì)粒（Tumor-inducingplasmid）的改建與利用，從而開創(chuàng)了植物基因工程的新紀元。根癌農(nóng)桿菌5第5頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二6第6頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二7第7頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二8第8頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二T－DNA9第9頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物基因工程中，我們把接受外源(目的)基因的生命體系稱為“受體”。受體包括：葉圓片(盤)、胚性愈傷、胚狀體、愈傷組織、懸浮細胞、原生質(zhì)體等不同的形態(tài)。其基本形態(tài)還是細胞。葉圓片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)是最簡單的轉(zhuǎn)化方法；愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率高、生長速度快，是快速檢測外源基因表達的最好受體；原生質(zhì)體則是單克隆轉(zhuǎn)化的最佳材料。3植物基因轉(zhuǎn)化的受體10第10頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)化植株（未）受精卵細胞花粉胚胚軸子葉葉片莖段萌發(fā)種子子房原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)細胞花器官根創(chuàng)傷植株塊莖莖尖植物基因轉(zhuǎn)化的外植體11第11頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二被轉(zhuǎn)化的受體細胞是單個獨立的細胞，為選擇遺傳均一性的轉(zhuǎn)基因植株提供了可能性。以懸浮細胞作受體的轉(zhuǎn)化方法包括：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG介導(dǎo)法、電激法和顯微注射法等。3.1懸浮細胞12第12頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二原生質(zhì)體是無細胞壁的細胞。與懸浮細胞一樣，被轉(zhuǎn)化的受體細胞是單個獨立的細胞，為選擇遺傳均一性的轉(zhuǎn)基因植株提供了可能性。3.2原生質(zhì)體13第13頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二愈傷組織容易大量制備愈傷組織的轉(zhuǎn)化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上獲得成功。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法最適合。3.3胚性愈傷組織14第14頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二胚狀體是由愈傷組織經(jīng)過改造后分化而來的，其轉(zhuǎn)化方法與愈傷組織相同。3.4胚狀體15第15頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二葉圓片是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的主要受體。也稱為葉盤法。用打孔器或解剖刀切取直徑3—5mm的葉圓片；在液體培養(yǎng)瓶中與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)20-30min；將葉圓片在濾紙上吸干；轉(zhuǎn)移到非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d；再移入含抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)；誘導(dǎo)植株再生；獲得轉(zhuǎn)基因植株。葉盤法常見于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。3.5葉圓片16第16頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二如子葉、胚軸、莖段、根、體細胞胚、花粉等3.6其他受體17第17頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Agrobacterium-mediatedtransformation)基因槍轉(zhuǎn)化法(Microprojectilebombardment)聚乙二醇-介導(dǎo)法(PEG-mediatedtransfomation)電激法(Electroporation)花粉管通道法(Pollen-tubepathway)顯微注射法(Microinjection)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Liposomestransformation)激光微束轉(zhuǎn)化法(Lasermicrobeampuncture)

4植物基因轉(zhuǎn)化的方法18第18頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacience)介導(dǎo)法是植物基因轉(zhuǎn)化中使用最普遍的一種方法。其Ti質(zhì)粒(Tumor-inducingplasmid)具有將DNA整合到植物染色體上，并使之與植物內(nèi)源基因同步表達的能力。每個Ti質(zhì)粒都有3個功能區(qū)域。一是T-DNA區(qū)，即轉(zhuǎn)化DNA區(qū)，與病癥發(fā)生有關(guān)的基因位于這個區(qū)，決定著腫瘤形態(tài)和冠癭堿的合成；二是Vir區(qū)，是T-DNA區(qū)以外的與感染腫瘤有關(guān)的區(qū)域；三是分解和利用冠癭堿的區(qū)域，分布著冠癭堿分解酶基因。4.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)法19第19頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二4.2微彈轟擊法原理：金屬微粒在外力作用下達到一定速度后，可以進入植物細胞，但又不引起細胞致命傷害，仍能維持正常的生命活動。也稱為基因槍法。利用這一特性，先將含目的基因的外源DNA同鎢、金等金屬微?；靹?，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨后用基因槍轟擊，使DNA隨高速金屬微粒進入植物細胞。此方法可直接處理植物某器官或某組織，是當今普遍使用的植物轉(zhuǎn)基因方法。20第20頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二21第21頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二聚乙二醇介導(dǎo)法與PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的機理相似，不同的是后者發(fā)生在原生質(zhì)體之間，而前者發(fā)生在原生質(zhì)體與DNA之間。在高濃度的二價鈣離子(Ca2+)和高pH值的條件下，略帶負電的高分子PEG可能促進DNA向原生質(zhì)體膜沉淀，或參與原生質(zhì)體的內(nèi)吞作用下，使外源DNA分子進入原生質(zhì)體和細胞核，并整合到染色體上。4.3聚乙二醇-介導(dǎo)法22第22頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二4.4電激法原理：細胞膜的基本組成是磷脂，在適當?shù)耐饧用}沖電場作用下，細胞膜被擊穿，但還達不到細胞致命傷害。所以當移去外加電場后，被擊穿的膜孔可自行復(fù)原。也稱為電穿孔法。根據(jù)這一性質(zhì)，植物原生質(zhì)體同外源DNA分子混合，置于電擊儀的樣品室中，按預(yù)定的參數(shù)進行直流電脈沖處理，再通過常規(guī)的再分化培養(yǎng)和篩選，可獲得轉(zhuǎn)基因植株。為避免制備原生質(zhì)體和原生質(zhì)體再生植株的困難，近來用此技術(shù)直接處理具有完整細胞壁的植物細胞、愈傷組織和花粉粒，均取得一定的效果。23第23頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二24第24頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二25第25頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二4.5花粉管通道法原理：將重組DNA涂于授粉的柱頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具有正常細胞壁的卵、合子和早期的胚胎細胞，在活體內(nèi)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子。26第26頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二花粉管通道法27第27頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二4.6顯微注射法原理：利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體的細胞質(zhì)或細胞核中。重要問題：必須把受體細胞進行固定。動物細胞具有獨特的貼壁生長待性，因此不存在固定細胞的問題。植物細胞的顯微注射必須建立固定細胞技術(shù)。目前有三種方法：①瓊脂糖（低熔點）包埋法；②多聚-L-賴氨酸粘連法；②吸管（毛細管）支持法。28第28頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二4.7脂質(zhì)體介導(dǎo)法原理：脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，把用來轉(zhuǎn)染的DNA分子包在其中，通過脂質(zhì)體與細胞接觸，將外源DNA導(dǎo)人受體細胞。包裝成脂質(zhì)體的DNA的轉(zhuǎn)染串比裸露的DNA的轉(zhuǎn)染率高出100倍。如先用PEG處理培養(yǎng)的受體細胞，使其易吸收培養(yǎng)基中的脂質(zhì)體，可提高轉(zhuǎn)染率10—20倍。在正常情況下，每個細胞平均可吸收1000個左右的脂質(zhì)體。這是哺乳動物轉(zhuǎn)基因研究中常用的方法之一。29第29頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二4.8激光微束穿孔法原理：利用直徑很?。{米級）、能量很高的激光微束可引起細胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下用激光處理細胞，處于細胞周圍的重組DNA隨之進入細胞。此方法最適用于活細胞中線粒體和葉綠體等細胞器的基因轉(zhuǎn)移。30第30頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二31第31頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植株再生是基因轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，直接決定能否獲得轉(zhuǎn)基因植株。兩種形式：一種是愈傷組織再生另一種是直接再生，從外植體直接誘導(dǎo)出芽而不經(jīng)過愈傷組織的分化。轉(zhuǎn)墓因植株再生的方式與一般植株再生的方式相同，主要區(qū)別是轉(zhuǎn)基因植株的再生受外源基因、載體系統(tǒng)、抗生素、轉(zhuǎn)化過程的影響。5轉(zhuǎn)基因植株的再生及其檢測方法5.1轉(zhuǎn)基因植株再生32第32頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二常采用報告基因作為標記，以便快速檢測。主要采用分子生物學方法檢測，包括：聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、Southern

Blot、NorthernBlot和WesternBlot等方法。進行分子生物學檢測以后還要進行生物學鑒定，以確定基因是否可以正常地表達性狀，并穩(wěn)定地遺傳給后代。如果一些有價值的目的基因被轉(zhuǎn)入，還必須鑒定基因的功能及其表型。5.2轉(zhuǎn)基因植株的檢測33第33頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二如轉(zhuǎn)化抗病毒基因：要對轉(zhuǎn)基因植物進行病毒接種，以鑒定抗病毒能力。若轉(zhuǎn)化的基因為抗除草劑基因：還要對植物噴灑除草劑進行檢測。若轉(zhuǎn)基因植物是食用糧食作物或油料：還要通過轉(zhuǎn)基因植物的安全性檢測，以免對人類和環(huán)境造成危害。如果轉(zhuǎn)化的是花色素合成酶基因：則憑肉眼就可直觀鑒定花色變化。34第34頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二35第35頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二6植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性

國際大討論36第36頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二斑蝶事件：1999年5月，康奈爾大學的一個研究組在《Nature》雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國大斑蝶，導(dǎo)致44％的幼蟲死亡?，F(xiàn)在這個事件也有了科學的結(jié)論：第一，玉米的花粉非常重，擴散不遠，在玉米地以外５米，每一平方厘米馬利筋葉片上只找到一個玉米花粉。第二，2000年開始在美國三個州和加拿大進行的田間試驗都證明，抗蟲玉米花粉對斑蝶并不構(gòu)成威脅，實驗室試驗中用10倍于田間的花粉量來喂大斑蝶的幼蟲，也沒有發(fā)現(xiàn)對其生長發(fā)育有影響。斑蝶減少的真正原因，一是農(nóng)藥的過度使用，二是墨西哥生態(tài)環(huán)境的破壞。37第37頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二加拿大“超級雜草”事件：由于基因漂流，在加拿大的油菜地里發(fā)現(xiàn)了個別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級雜草”。事實上，這種油菜在噴施另一種除草劑2，4-Ｄ后即被全部殺死。應(yīng)當指出的是，“超級雜草”并不是一個科學術(shù)語，而只是一個形象化的比喻，目前并沒有證據(jù)證明已經(jīng)有“超級雜草”的存在。同時，基因漂流并不是從轉(zhuǎn)基因作物開始，而是歷來都有。如果沒有基因漂流，就不會有進化，世界上也就不會有這么多種的植物和現(xiàn)在的作物栽培品種。38第38頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二墨西哥玉米事件：2001年11月，美國加州大學伯克萊分校的兩位研究人員在《Nature》上發(fā)表文章，聲稱在墨西哥南部Oacaca地區(qū)采集的６個玉米地方品種樣本中，發(fā)現(xiàn)有CaMV35S啟動子及NovartisBtll抗蟲玉米中的adh1基因相似序列。綠色和平組織借此大肆渲染，說墨西哥玉米已經(jīng)受到了“基因污染”，甚至指責墨西哥小麥玉米改良中心的基因庫也可能受到了“基因污染”。文章發(fā)表后受到很多科學家的批評，。所謂測出的35S啟動子，經(jīng)復(fù)查證明是假陽性。所稱Ｂｔ玉米中的adh1基因已經(jīng)轉(zhuǎn)到了墨西哥玉米的地方品種，也是假的。轉(zhuǎn)入Ｂｔ玉米中的基因序列是adh1

-S基因，而作者測出的是玉米中本來就存在的adh1

-IF基因，兩者的基因序列完全不同，是兩碼事。顯然作者沒有比較這兩個序列，審稿人和《Nature

》編輯部也沒有核實。墨西哥小麥玉米改良中心（CIMMYT）也發(fā)表聲明指出，經(jīng)對種質(zhì)資源庫和新近從田間收集的152份材料的檢測，在墨西哥任何地區(qū)都沒有發(fā)現(xiàn)35S啟動子。39第39頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二中國Ｂｔ抗蟲棉破壞環(huán)境事件：2003年６月３日，南京環(huán)科所與綠色和平組織在北京召開會議，６月４日《ChinaDaily》上發(fā)表了題為“GMCottonDamageEnvironment”的文章，亦即“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉破壞了環(huán)境”。綠色和平組織也于當天在其網(wǎng)站上刊登了南京環(huán)科所、綠色和平組織顧問薛達元先生長達26頁的英文報告，從而再次引發(fā)國際爭論，在歐、美產(chǎn)生巨大反響，成為國際上爭論轉(zhuǎn)基因作物安全性的重大事件之一。40第40頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二6月5日德國《農(nóng)業(yè)報》發(fā)表了題為“ChineseResearch:largeEnvironmentDamagebyBtCotton”的文章，即：“中國研究：Bt棉破壞環(huán)境巨大”。綠色和平組織的“中國項目主管”盧思聘聲稱：棉農(nóng)“將面對不受控制的超級害蟲”（這里他又全無科學根據(jù)地提出了“超級害蟲”的新名詞！），“聲稱可以減少農(nóng)藥使用的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，不但沒有解決問題，反而制造了更多的問題”，“（棉農(nóng)）將被迫使用更多、更毒的化學農(nóng)藥”。抗蟲棉在中國實踐多年，深受廣大棉農(nóng)的歡迎，相信不會同意他的這些結(jié)論。中國、美國、德國、加拿大、比利時、印度等國的科學家已在網(wǎng)上紛紛發(fā)表評論，反駁綠色和平組織的觀點。41第41頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二（1）國際轉(zhuǎn)基因作物爭論的實質(zhì)并不純粹是科學問題，而是經(jīng)濟和貿(mào)易問題。現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因作物的安全性已經(jīng)成了國際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。（2）爭論應(yīng)該以科學為基礎(chǔ)，目前批準商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品還沒有發(fā)現(xiàn)環(huán)境和食品安全性問題。長期效應(yīng)需要跟蹤，包括非預(yù)期效應(yīng)，但非預(yù)期效應(yīng)的分析必須與安全性評價相結(jié)合。（3）歸結(jié)到一點，今天與反生物技術(shù)組織的爭論，是要不要轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品、要不要科學和