反義核酸技術(shù)及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

反義核酸技術(shù)及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展反義核酸是指能與特定mRNA精確互補(bǔ)、特異阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達(dá)，使之低表達(dá)或不表達(dá)，這種技術(shù)即為反義核酸技術(shù)[1-3]。它包括反義RNA、反義DNA和核酶(ribozymes)三大技術(shù)。反義核酶作為一種基因下向調(diào)整作用因子，在抑制一些有害基因的表達(dá)和失控基因的過度表達(dá)上發(fā)揮著重要作用。隨著反義核酶技術(shù)的進(jìn)展和成熟，已漸漸應(yīng)用于抗某些人體寄生蟲病的討論。本文擬就反義核酸技術(shù)的作用原理和特點(diǎn)作一簡要概述，著重闡述其在寄生蟲領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展。1反義核酸的作用原理

反義核酸目前有三種來源：一是利用固相亞磷酰胺法人工合成的短小反義寡聚核苷酸(antisenseoligodeoxyncleotides，AON)，這是反義核酸最普遍的應(yīng)用方式，包括未修飾AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修飾AON二類，其中以PSAON應(yīng)用最廣泛。ANO設(shè)計(jì)合成簡潔，只要其挨次與靶mRNA部分挨次互補(bǔ)即可，而對(duì)基因的讀碼框無要求；二是更具有有用價(jià)值的工人表達(dá)載體，包括單個(gè)基因和多個(gè)基因的聯(lián)合反義表達(dá)載體[3]，它是利用基因重組技術(shù)將靶基因序列反向持插入到載體的啟動(dòng)子和終止子之間，通過轉(zhuǎn)錄可源源不斷產(chǎn)生反義RNA分子；三是自然?存在的反義核酸分子，但目前分別純化尚存在困難。

1.1反義RNA和反義DNA

反義RNA是指能和mRNA完全互補(bǔ)的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段，反義DNA是指能與基因DNA雙鏈中的有義鏈互補(bǔ)結(jié)合的短小DNA分子。反義RNA和反義DNA主要是通過mRNA的翻譯和基因DNA的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用[10]：1)抑制翻譯。反義核酸一方面通過與靶mRNA結(jié)合形成空間位阻效應(yīng)，阻擋核糖體與mRNA結(jié)合，另一方面其與mRNA結(jié)合后激活內(nèi)源性RNase或ribozyme，降解mRNA[3]；2)抑制轉(zhuǎn)錄。反義DNA與基因DNA雙螺旋的調(diào)控區(qū)特異結(jié)合形成DNA三聚體(triplex),或與DNA編碼區(qū)結(jié)合，終止正在轉(zhuǎn)錄的mRNA鏈延長[3]。此外，反義核酸還可抑制轉(zhuǎn)錄后mRNA的加工修飾，如5'端加帽、3'端加尾(polya)、中間剪接和內(nèi)部堿基甲基化等，并阻擋成熟mRNA由細(xì)胞核向細(xì)胞漿內(nèi)運(yùn)輸。

1.2核酶

Cech等發(fā)覺四膜蟲核糖體RNA前體在成熟過程中，可精確地自我切除某些片段并重新連接，這種具有酶催化活性的RNA稱之為核酶[11,12]。

核酶廣泛存在于生物細(xì)胞中，有錘頭狀和發(fā)夾二種結(jié)構(gòu)。酶活性中心由兩個(gè)臂和中間的功能區(qū)組成[13]。兩個(gè)臂序列高度保守，與靶RNA特異互補(bǔ)結(jié)合，相當(dāng)于一種反義RNA，而功能區(qū)則可通過降解RNA的磷酸二酯鍵而分解消化靶RNA，而核酶本身在作用過程中并不消耗。核酶裂解分子依靠嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)形成，裂解部位總是位于靶RNA分子中GUX三聯(lián)體(X：C、U、A)下游方向即3'端[12]。

核酶除自然?存在外，也可人工合成。依據(jù)核酶的作用位點(diǎn)、靶mRNA四周的序列和核酶本身高度保守序列，可便利地人工設(shè)計(jì)合成核酶的特異性序列。此外，利用基因工程將核酶的編碼基因克隆在SP6或T7等啟動(dòng)子下游，通過轉(zhuǎn)錄合所需核酶。核酶能特異切割RNAA分子，使阻斷基因表達(dá)，特殊是阻斷有害基因的表達(dá)成為可能。假如已知靶mRNA中GUX三聯(lián)體的位置，可將核酶的編碼基因插入反義表達(dá)載體的適當(dāng)位置，這樣轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的含有核酶的反義RNA具有雙重功能：一方面具有反義抑制作用，另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。核酶在抗腫瘤、抗病毒方面具有非常迷人的前景，第一個(gè)應(yīng)用核酶進(jìn)行艾滋病基因治療的臨床方案已獲準(zhǔn)，核酶作為一種遺傳信息藥物，在腫瘤基因治療中必將日益受到重視。

2反義核酸的作用特點(diǎn)

反義核酸作為基因治療藥物之一，與傳統(tǒng)藥物相比具有諸多優(yōu)點(diǎn)。1)高度特異性：反義核酸藥物通過特異的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用于靶RNA或DNA，如同“生物導(dǎo)彈”。2)高生物活性、豐富的信息量；反義核酸是一種攜帶特定遺傳信息的信息體，堿基排列挨次可千變?nèi)f化，不行窮盡。3)高效性：直接阻擋疾病基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。4)最優(yōu)化的藥物設(shè)計(jì)：反義核酸技術(shù)從本質(zhì)上是應(yīng)用基因的自然?挨次信息，實(shí)際上是最合理的藥物設(shè)計(jì)。5)低毒、平安：反義核酸尚未發(fā)覺其有顯著毒性，盡管其在生物體內(nèi)的存留時(shí)間有長有短，但最終都將被降解消退，這避開了如轉(zhuǎn)基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危急性。

3反義核酸技術(shù)在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用

反義核酸技術(shù)的飛速進(jìn)展和成熟，使其漸漸滲透并應(yīng)用到寄生蟲學(xué)領(lǐng)域，豐富和進(jìn)展了寄生蟲病的基因治療策略。反義核酸技術(shù)在抗寄生蟲病討論的應(yīng)用主要集中于原蟲類，如瘧原蟲、錐蟲和利什曼原蟲等，而且反義核酸中又以AON方面的報(bào)道最多。下面著重就AON在寄生蟲方面的討論應(yīng)用作用一簡要闡述。

3.1瘧原蟲

瘧原蟲嘌呤核苷酸合成具有特別性，即無從頭合成途徑，依靠補(bǔ)救合成途徑利用體內(nèi)游離的嘌呤或嘌呤核苷。瘧原蟲的二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase，DHFR)和胸苷酸合酶(thymidylatesynthase，TS)結(jié)合形成雙功能蛋白(DHFR-TS)，這對(duì)于維持瘧原蟲四氫葉酸水平和DNA合成極為重要[14]，此酶也是瘧原蟲脫氧胸苷酸生物合成唯一通路中必不行少的酶。抗瘧藥中的抗葉酸代謝藥如乙胺嘧啶，就是通過競爭性抑制DHFR-TS來阻斷蟲體脫氧胸苷酸生物合成[15]。然而，隨著惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)多藥抗性株的消失和廣為傳播，瘧疾的化療面臨重大挑戰(zhàn)，促使人們尋求新的抗瘧療法。目前，DHFR-TS是AON抗瘧作用首選靶基因。

生物大分子進(jìn)入感染紅細(xì)胞中的瘧原蟲，必需穿透三層膜，即紅細(xì)胞膜、納蟲泡膜和蟲體的胞質(zhì)膜。討論表明，不能穿透紅細(xì)胞膜和納蟲泡膜的大分子和葡聚糖、IgG2a抗體和蛋白A等，可經(jīng)過納蟲微管(parasitophorousduct)進(jìn)入蟲體，蟲體通過胞吞作用直接從細(xì)胞外攝入大分子物質(zhì)[16]。因此，對(duì)于小分子的AON而言，作用于感染紅細(xì)胞中的蟲體完全成為可能，下述眾多討論已充分證明白這一點(diǎn)。Rapaport等(1992)討論發(fā)覺[17]，以DHFR-TS為靶21ntPSAON能選擇性地進(jìn)入惡性瘧原蟲感染紅細(xì)胞，對(duì)體外培育的氯喹敏感株和耐藥株蟲體具有同等的抑制效果，而未感染瘧原蟲的紅細(xì)胞則完全為不攝入AON，因此這對(duì)應(yīng)用反義核酸于抗瘧治療特別有利。

諸多討論表明，AON越長，對(duì)轉(zhuǎn)譯的抑制作用就越強(qiáng)；AON濃度越高，非特異性抑制作用越明顯，在低濃度時(shí)則呈特異性抑制。Sartorius和Franklin(1991)以DHFR-TS的mRNA為靶合成系列AON，利用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，探討AON對(duì)體外轉(zhuǎn)譯的抑制作用[18]。在DHFR翻譯起始位點(diǎn)處合成了6條21－49nt不等長的AON，在TS編碼區(qū)全成的30nt、39nt和49nt三條AON。當(dāng)AON長度為30nt或更長時(shí)，呈明顯轉(zhuǎn)譯抑制作用，抑制率可高達(dá)50％以上。其中，TS編碼區(qū)的49ntaON(OTS49)抑制效果最高，當(dāng)濃度在45μmlo/L時(shí)的抑制率幾乎達(dá)90％，主要是由于OTS49與DHFR-TS靶mRNA結(jié)合抑制TS合成，這從翻譯產(chǎn)物的分子量(55kDa)要比自然?DHFR-TS(71kDa)小且無TS活性可看出。

Ramasamy等和Clark等討論表明，在較高濃度下，無論DHFR-TS正義還是反義的寡聚核苷酸(M1K，M2K)，均能抑制裂殖子入侵紅細(xì)胞[19,20]。究其緣由，可能與高濃度的AON帶有較多的負(fù)電荷有關(guān)。Kanagaratnam等(1998)分析了瘧原蟲裂殖子表面蛋白基因的反義和正義寡聚核苷酸對(duì)瘧原蟲體外生長的影響[21]，無論AON單獨(dú)使用抑或與脂質(zhì)體混合使用，均未觀看到特異抑制效應(yīng)。但在相同濃度范圍內(nèi)，反義和正義寡核苷酸以及具有多聚陰離子的硫酸葡聚糖，均可抑制裂殖子入侵紅細(xì)胞。當(dāng)寡聚核苷與陽離子脂質(zhì)體結(jié)合后負(fù)電荷被中和時(shí)，則對(duì)裂殖子入侵紅細(xì)胞的抑制作用被取消。由此推想，寡聚核苷酸有可能借助其多聚陰離子特性干擾裂殖子與細(xì)胞上受體結(jié)合，多聚陰離子可能對(duì)瘧疾病治療有關(guān)心。

3.1.2AON不同修飾物對(duì)抗瘧作用影響

最近，Barker等以DHFR-TS基由于靶，比較了硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化修飾AON，以及不同空間結(jié)構(gòu)AON對(duì)體外培育蟲體生長抑制作用[22]。結(jié)果顯示，5'和3'端至少含有3個(gè)PS基因的PO-PS雜合體AON、全部為PS修飾的AON，與部分PS修飾的AON抑制作用相同。在低濃度下(1μmol/L)，PO-PSaON和PSAON比PS-甲基化AON抑制率高25％。此外，通過延長AON序列增加干-環(huán)結(jié)構(gòu)形成，提高AON的自我穩(wěn)定性，結(jié)果獲得2個(gè)有干-環(huán)結(jié)構(gòu)的AON(RB39、RB41)，其抑蟲生長率比序列未延長的AON約要高20％。

3.1.3AON不同靶基因?qū)汞懽饔糜绊?/p>

AON對(duì)不同基因的抑制作用不全都，這和該基因在蟲體代謝過程中是否起舉足輕重作用親密相關(guān)[14]。AON的抗瘧討論主要集中在DHFR-TS基因，這當(dāng)然與其在瘧原蟲核苷酸代謝中的特別地位有關(guān)(見前述)。Barker等(1996)對(duì)惡性瘧原蟲耐藥株多個(gè)靶基因的AON作用進(jìn)行了比較討論[23]，方法是將PSaON加入到瘧原蟲體外培育液中，培育48小時(shí)后，通過鏡檢和3氚-次黃嘌呤摻入試驗(yàn)觀看AON對(duì)蟲體的生長抑制作用。結(jié)果表明，抑制作用與AON濃度親密相關(guān)。當(dāng)AON濃度為1μmol/L時(shí)，AON呈非特異性抑制；當(dāng)濃度在0.5－0.005μmol/L范圍時(shí)，以DHFR-TS、二氫喋呤合成酶、核苷酸還原酶、裂殖體多基因家族和紅細(xì)胞結(jié)合抗原-175為靶的PSaON與對(duì)比組相比，均能特異地顯著抑制蟲體生長(P＜0.0001)，而DNA聚合酶α的PSaON抑制作用更弱，磷酸丙糖異構(gòu)酶的PSAON抑制作用則與對(duì)比組相同。

瘧原蟲感染紅細(xì)胞中，近75％血紅蛋白被滋養(yǎng)體降解而形成大量對(duì)蟲體有害的血紅素，必需在消化泡中聚集成對(duì)蟲體無毒的瘧色素[24,25]。討論表明，惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白(HRP)家族中，HRPⅡ和HRPⅢ有明顯的促進(jìn)瘧色素形勝利能[26]。因此，如能特異阻斷這些基因表達(dá)，抑制瘧色素的形成，有可能使之成為一種抗瘧新途徑。HRPⅡ與HRPⅢ從同一祖先基因分化而來，二者高度同源，翻譯起始位點(diǎn)附核苷酸序列則完全相同[27,28]。

3.2錐蟲

屬于動(dòng)基體目的布氏錐蟲(Trypanosomaburcei)通過抗原不斷變異躲避宿主的免疫力，抗原變異是由于不同的變異體專一表面糖蛋白(variant-specificsurfaceglycoprotein，VSG)基因呈間斷表達(dá)所致，VSG基因表達(dá)產(chǎn)物在錐蟲表面形成外膜，掩蓋蟲體[29,30]。討論表明，VSGmRNA可分為二部分[31,32]：一部分是各種變異體特有的主外顯子序列，占主要部分；另一部分是共同的5'端小外顯子序列，通常為35個(gè)核苷酸長，幾乎全部的VSGmRNA均含有此序列。實(shí)際上，除VSG外，錐蟲的鈣調(diào)蛋白、微管蛋白和磷酸丙糖異構(gòu)酶mRNA中也存在共同的5'端小外顯子序列，這好像是動(dòng)基體目寄生原蟲編碼基因的共同結(jié)構(gòu)特征[32]。由于宿主mRNA無這種小外顯子序列，以小外顯子序列為靶的AON就很簡單實(shí)現(xiàn)抑制眾多基因表達(dá)的效果，使反義核酸抗錐蟲感染成為可能。

Cornelissen等應(yīng)用麥胚提取物轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)、35S-甲硫氨酸摻入試驗(yàn)和蛋白質(zhì)SDS方法[33]，對(duì)與錐蟲小外顯子序列不同位點(diǎn)互補(bǔ)和不同長度的AON體外轉(zhuǎn)譯抑制作用進(jìn)行了比較分析。結(jié)果全部AON均能抑制轉(zhuǎn)錄，且抑制程度與AON長度和濃度有關(guān)，AON越長，濃度越高則抑制作用越強(qiáng)。如3個(gè)12nt和AON抑制率達(dá)35％－60％，而22nt和34ntaON在濃度為15－30μmol/L時(shí)對(duì)錐蟲總RNA轉(zhuǎn)錄抑制率高達(dá)95％－100％。在同一轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中，BMV病毒(BromemosaicVirus)和無小外顯子序列的錐蟲磷酸甘油酸激酶mRNA卻完全不受34ntAON的抑制，與錐蟲小外顯子序列不互補(bǔ)的18ntAON對(duì)錐蟲轉(zhuǎn)譯則無任何影響。上述發(fā)覺充分證明，以錐蟲5'端小外顯子mRNA序列為靶的AON對(duì)轉(zhuǎn)譯具有特異抑制作用。

Walder等用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)，也獲得上述相類似的結(jié)果[31]。Verspieren等討論表明[34]，小外顯子AON的二級(jí)結(jié)構(gòu)和堿基的修飾會(huì)直接影響其與靶mRNA的親和性，從而間接影響AON的轉(zhuǎn)譯抑制效果。如上述與小外顯子第2位至第13位堿基互補(bǔ)的12ntaON，雖然抑制布氏錐蟲轉(zhuǎn)譯，但不能抑制活動(dòng)錐蟲(Trypanosomavivax)mRNA轉(zhuǎn)譯，這明顯與二種蟲體的小外顯子第3位和第7位堿基不同有關(guān)。

Verspieren等首次嘗試用吖啶衍生物(acridinederivative)修飾布氏錐蟲5'端小外顯