細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)方法相關(guān)知識(shí)

細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)方法相關(guān)知識(shí)首先談?wù)劶?xì)菌內(nèi)毒素的概念。細(xì)菌內(nèi)毒素，英文稱作，是G-菌細(xì)胞壁個(gè)層上的特有結(jié)構(gòu)，內(nèi)毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細(xì)胞等，使之釋放出一種內(nèi)源性熱原質(zhì)，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱。細(xì)菌內(nèi)毒素的主一般細(xì)菌毒素可分為兩類，一類為外毒素（Exotoxin）；它是種毒性蛋白質(zhì)，是細(xì)菌在生長過程中分泌到菌體外的毒性物質(zhì)。產(chǎn)生外毒素的細(xì)菌主要是革蘭氏陽性菌。如白喉?xiàng)U菌、破傷風(fēng)桿菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌以及少數(shù) 革蘭氏陰性菌。另一類為內(nèi)毒素（Endotoxin）。是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁的產(chǎn)物。細(xì)菌在生活狀態(tài)時(shí)不釋放出來，只有當(dāng)細(xì)菌死亡自溶或粘附在其它細(xì)胞時(shí)，才表現(xiàn)其A細(xì)菌內(nèi)毒素和熱原的關(guān)系、熱原反應(yīng)熱原（pyrogen）它包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。細(xì)菌內(nèi)毒素被認(rèn)為是熱原的本質(zhì)，此事在學(xué)術(shù)上仍有爭議，熱原不僅是細(xì)菌內(nèi)毒素。但在藥檢的范疇，細(xì)菌內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說無內(nèi)毒素就無熱原，控制內(nèi)毒素就是控制熱原。熱原反應(yīng)：含有熱原的注射劑注入人體可引起發(fā)熱反應(yīng)，使人體產(chǎn)生發(fā)冷、寒戰(zhàn)、體溫升高、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時(shí)體溫可升至40℃，嚴(yán)重者甚至昏迷、虛脫，如不及時(shí)搶救，可危及生命。去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法吸附法此法是利用活性炭對(duì)熱原的吸附作用達(dá)到去除作用的方法。常用的吸附劑中，活性炭對(duì)熱原的吸附作用最強(qiáng)，一般用量為總?cè)萘康?.1%-0.5%，將溶液加熱到70℃左右保溫一定時(shí)間效果更好。使用的活性炭應(yīng)符合藥典規(guī)定要求。蒸餾法此法是利用熱原具有不揮發(fā)性而達(dá)到去除目的。因此，凡適于蒸餾的藥品均可用蒸餾法除去熱原。熱破壞法此法是利用熱高溫能破壞熱原質(zhì)達(dá)到去除目的。因此，凡適用于高溫處理的如熱原檢查試驗(yàn)中接觸藥液的容器，可用180℃干烤3小時(shí)，或250℃干烤30min以上。強(qiáng)酸強(qiáng)堿處理法此法利用強(qiáng)酸強(qiáng)堿能破壞熱原而達(dá)到去除的目的。其他，也可以采用過濾等方法去除熱原。熱原及內(nèi)毒素檢驗(yàn)方法家兔熱原法由于家兔對(duì)熱原的反應(yīng)與人基本相似，家兔法為各國藥典規(guī)定的檢查熱原的法定方法?！吨袊幍洹?005年版規(guī)定的熱原檢查法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性取決于試驗(yàn)動(dòng)物的狀況、試驗(yàn)室條件和操作的規(guī)范性。家兔法檢測內(nèi)毒素的靈敏度為 0.001μg/ml,試驗(yàn)結(jié)果接近人體真實(shí)情況，但操作繁瑣費(fèi)時(shí)，不能用于注射劑生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控，且不適用于放射性藥物、腫瘤抑制劑等細(xì)胞毒性藥物劑。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（鱟試劑法）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法．細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）表示。細(xì)菌內(nèi)毒素這個(gè)概念在1890年的時(shí)候就已被提了出來，它是在研究發(fā)熱物質(zhì)過程所引起的，年Boivin最先由小鼠傷寒桿菌提取出來，進(jìn)行化學(xué)免疫學(xué)方面的研究，到1940年時(shí)候，Morgan使用志賀氏痢疾菌闡明了細(xì)菌內(nèi)毒素是由多糖脂質(zhì)及蛋白質(zhì)三部分所組成的復(fù)合體，到了1950學(xué)等的進(jìn)步發(fā)展，細(xì)菌內(nèi)毒素的研究工作，尤其是其化學(xué)結(jié)構(gòu)組成及各種生物活性間的關(guān)系也更加明確起來。1956年美國人Bang發(fā)現(xiàn)美洲鱟血液遇革蘭氏陰性菌時(shí)會(huì)產(chǎn)生凝膠。其后Levin和Bang又搞清楚微量革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素也可以引起凝膠反應(yīng)，從而創(chuàng)立了鱟試劑檢測法。由于鱟試劑法簡單﹑快速﹑靈敏﹑準(zhǔn)確，已廣泛用于臨床、制藥工業(yè)藥品檢驗(yàn)等方面。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括凝膠法和光度測定法兩種方法，前者利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法，系分別利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化及產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少來測定內(nèi)毒素。鱟試劑法檢查內(nèi)毒素的靈敏度為0.0001μg/ml,比家兔法靈敏10倍，操作簡單易行，試驗(yàn)費(fèi)用低，結(jié)果迅速可靠，適用于注射劑生產(chǎn)過程中的熱原控制和家兔法不能檢測的某些細(xì)胞毒性藥物制劑，但其在 美國， 鱟試驗(yàn)被稱作為“細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)（BacterialEndotoxin收載于1980年20版美國藥典。隨后英、德、意、日以及中國相繼在藥典中收載了這一檢查法。此后鱟試驗(yàn)逐漸替代家兔熱原試驗(yàn)，但由于部分藥品由于自身特殊性無法通過稀釋法消除干擾，因此鱟試驗(yàn)還無法完全取代家兔熱原試驗(yàn)2005年版中國藥典規(guī)定168個(gè)品種進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，并收錄了2種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：包括凝膠法和光度測定法兩種方法。前者利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來定性檢測或半定量內(nèi)毒素，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)（比色）法，系分別利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化及產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少來定量測定內(nèi)毒素。比色法又可分為終點(diǎn)顯（比）色法和動(dòng)態(tài)比色法。該方法靈敏度、精密度高。國內(nèi)如廈門鱟試劑廠早在05年即有顯色基質(zhì)（終顯色）鱟試劑盒上市。凝膠法、比濁法、顯色法的原理圖：最常用方法：細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法簡介原理：常用英文縮寫B(tài)ET：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查BET水：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水MVD：供試品最大有效稀釋倍數(shù)NC：陰性對(duì)照MVC：供試品最低有效濃度PC：陽性對(duì)照λ：鱟試劑靈敏度L：供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值儀器：作用：干烤去熱原方式：250℃干烤30min以上。注意事項(xiàng)：從溫度達(dá)到250℃開始計(jì)時(shí)。干烤過程中不得開啟干燥箱的門。干烤物品不要疊放不要裝載過滿，以免影響空氣流通。漩渦混合器作用：混旋細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度一致。方式：對(duì)凍干粉的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后，應(yīng)混旋15min。標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋過程中，每步稀釋應(yīng)混旋30s.漩渦混合后漩渦混合前試管恒溫儀：作用：提供37℃恒溫的環(huán)境。方式：對(duì)加入了內(nèi)容物的鱟試劑分別放置于試管恒溫儀中，37℃恒溫60min±2min溫育培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。試劑：細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品：工作標(biāo)準(zhǔn)品、國家標(biāo)準(zhǔn)品鱟試劑：利用鱟血液中的變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機(jī)械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物，能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅(jiān)固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)，是體外檢測內(nèi)毒素的敏感試劑。<0.015eul="">，不引入細(xì)菌內(nèi)毒素，對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用。試驗(yàn)過程：在進(jìn)行日常檢驗(yàn)前，需要進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核和供試品干擾試最小稀釋倍數(shù)。靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：試驗(yàn)舉例：內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為支；λ＝0.25EU/ml。制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：取工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用75％酒精擦拭后啟開，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻15min如下：溶解鱟試劑：若鱟試劑為0.1ml裝量，則取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鱟試劑裝量大于0.1ml，則取若干支，按標(biāo)示量加入 BET 水溶解，再取 0.1ml 分裝于標(biāo)準(zhǔn)玻璃試管（10mm×75mm），將試管按如下形狀排列。3）加樣：每列每支加入相應(yīng)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各第五列加入BET水0.1ml。反應(yīng)及結(jié)果判斷：加樣結(jié)束后用封口膜封口，輕振動(dòng)混勻，置37水浴中保溫 60±2min，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn) 180°，凝膠不變形為“＋”，凝膠不能保持完整為“－”。當(dāng)2.0λ四支管都為陽性，0.25λ四支管都為陰性時(shí)，試驗(yàn)成立，λc：λc＝lg-1(∑X/4)（X:反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值。）當(dāng)0.5λ≤λc≤2.0λ時(shí)，鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，檢測時(shí)仍以標(biāo)示靈敏度λ為準(zhǔn)。樣品的干擾試驗(yàn)注：當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。（注：須三個(gè)批號(hào)以上的供試品，兩個(gè)以上鱟試劑廠家的試劑）品在該濃度下是否對(duì)內(nèi)毒素檢查有干擾。備一系列濃度的內(nèi)毒素溶液，詳見下表：內(nèi)毒素濃度/配編號(hào)制內(nèi)毒素的溶稀釋用液劑

稀釋倍數(shù)的濃度

平行管數(shù)A 無/供試品溶液－ － － 21 2λ 42λ/供試品溶22λ/供試品溶21λ4液 供試品溶液40.5λ480.25λ4122λ1λ444 0.5λ48 0.25λ4 0.5λ48 0.25λ4D無/檢查用水－－－2A：供試品溶液B：供試品陽性對(duì)照C：陽性對(duì)照D：陰性對(duì)照結(jié)果判定：當(dāng)供試品陰性對(duì)照A和陰性對(duì)照D都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。分別計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液和稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）；ES=lg-1(ΣXS/4)Et=lg-1(ΣXt/4)當(dāng)ES在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5ES～2ES（包括0.5ES和2ES）時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。導(dǎo)致干擾的因素及解決方案：導(dǎo)致干擾的因素：pH值抗凝因子螯合劑葡聚糖

稀釋4.3.5.3樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)細(xì)菌內(nèi)毒素限值L的確定藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）除藥典有規(guī)定的，一般按以下公式確定：L＝K／MK為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5EU/(kg·h)，放射性藥品注射劑K=2.5EU/(kg·h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kg·h)；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示，人均體重按60kg計(jì)算，人體表面積按1.62㎡計(jì)算。注射時(shí)間若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量（M）按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。限值確認(rèn)時(shí)要遵循從嚴(yán)原則，要考慮病人在疾病狀態(tài)的耐受力和可能存在的聯(lián)合用藥的情況。C·LMVD＝λλ：(EU/ml)。L：供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值。C當(dāng)L溶液）1ml/ml；當(dāng)L單位為EU/mg或者EU/u時(shí)（抗生素原料），C的單位為mg/ml或者u/ml。供試品溶液稀釋：將供試品稀釋，稀釋倍數(shù)為2λ的制備：8BET0.1ml20.1ml；2BET水0.1ml；2支為陽性對(duì)照管，加入22λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ml；2支為樣品陽性管，加入0.1ml2λ37±1℃水浴中保溫60±1min。結(jié)果判斷：陽性對(duì)照為陽性陰性對(duì)照為陰性試驗(yàn)結(jié)果成立樣品陽性對(duì)照為陽性2支樣品管均為陰性時(shí)，樣品符合規(guī)定；2支樣品管均為陽性時(shí)，樣品不符合規(guī)定；樣品