IOS15189認(rèn)可過程中臨床分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理體會(huì)

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院呂虹寫在課前的話ISO15189的條款有15個(gè)管理?xiàng)l款，以及8個(gè)技術(shù)要求。從整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的條款來(lái)說，對(duì)這23個(gè)條款都是需要非常關(guān)注的，對(duì)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可是非常重要的。通過本課程學(xué)習(xí)，您將充分掌握臨床分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的技術(shù)要求。實(shí)驗(yàn)室管理文件指南的制定應(yīng)當(dāng)參考哪些資料？一、指南主要依據(jù)以下指南或文件來(lái)制定自己的實(shí)驗(yàn)室管理文件，并且依據(jù)自己制定的文件來(lái)管理實(shí)驗(yàn)室，CNAS-GL26：2008醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的指南；CNAS-CL02：2008《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》；衛(wèi)生部衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2002〕10號(hào)文件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》。衛(wèi)生部2002年就頒布了《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》，但是CNAS直到2008年才將臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室納入到實(shí)驗(yàn)室范圍之中，這也是考慮到臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室也是一個(gè)特殊的實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家對(duì)它已經(jīng)出臺(tái)了嚴(yán)格的要求。但是在CNAS的前言當(dāng)中也描述了，CNAS對(duì)持有許可證的基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室不可以豁免評(píng)審；即使是獲得了衛(wèi)生部頒發(fā)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可證書，也不能代替CNAS的認(rèn)可，也就是說這2個(gè)證書是不通用的。CNAS對(duì)CPR的認(rèn)可條款不是一個(gè)強(qiáng)制性的條款，建議性為主，很多地方都用到了“以”或者是“需”這樣的字眼來(lái)表達(dá)，期望醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室盡量能夠滿足的要求。任何一個(gè)參加認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室都要有自己的實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量體系文件，文件分為4個(gè)部分。A.質(zhì)量手冊(cè)（質(zhì)量方針、質(zhì)量目標(biāo)）；B.程序文件（描述為實(shí)施質(zhì)量體系要素所涉及的各職能部門的活動(dòng)）；C.標(biāo)準(zhǔn)操作程序（詳細(xì)的作業(yè)指導(dǎo)書SOP文件）；D.記錄表格（后面詳述）。如果作為一個(gè)獨(dú)立的臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的申請(qǐng)，就要有自己的獨(dú)立的文件體系。如果PCR實(shí)驗(yàn)室只是作為ISO15189實(shí)驗(yàn)室的一部分，可以和整個(gè)大的實(shí)驗(yàn)室使用一套管理體系，但是部分程序文件、標(biāo)準(zhǔn)操作程序、記錄表格都是要獨(dú)立的。作為自己的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說，就是醫(yī)院的PCR實(shí)驗(yàn)室來(lái)講，2004年就申請(qǐng)了臨床基因?qū)嶒?yàn)室并且獲得了認(rèn)可，當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)室使用的就是自己實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立的質(zhì)量管理體系文件。有自己的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，有自己的質(zhì)量手冊(cè)和自己的程序文件，包括SOP文件和記錄表格，沒有和大實(shí)驗(yàn)室的ISO15189使用統(tǒng)一體系文件。帶濾芯的吸頭的質(zhì)檢，也是在試驗(yàn)當(dāng)中經(jīng)常使用到的耗材，主要是密封性的質(zhì)檢，有一個(gè)非常簡(jiǎn)單的方法來(lái)檢測(cè)帶濾芯的吸頭密封性。首先制備一個(gè)含氧色素的水溶液，甲基橙、藍(lán)墨水、紅墨水都可以，吸頭的最大體積是100μl，就是100μl的吸頭，把樣槍跳到110或者120μl，再套上帶濾芯的吸頭，去吸有色液體。如果吸頭質(zhì)量好，液體不應(yīng)該出現(xiàn)在濾芯之上，否則這個(gè)濾芯不嚴(yán)，這是檢測(cè)帶濾芯吸頭的一個(gè)簡(jiǎn)單方法。圖

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PCR實(shí)驗(yàn)室日常工作核查表圖1為PCR實(shí)驗(yàn)室日常工作核查的表格，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)前、試驗(yàn)中、試驗(yàn)后都要進(jìn)行核查，確保沒有漏項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)前要進(jìn)行紫外線的消毒，看消毒液是不是新鮮配置的、工作臺(tái)面有沒有進(jìn)行消毒、所需要的物品是否進(jìn)行了高溫滅菌。在實(shí)驗(yàn)過程中，各個(gè)區(qū)域的物品不能進(jìn)行混用，包括加樣器、筆、紙都是不能混用的。在實(shí)驗(yàn)過程中一定要做陰性對(duì)照，弱陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性、質(zhì)控品這些都是需要做的。自己的實(shí)驗(yàn)室不是弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性都做，只做弱陽(yáng)性的對(duì)照品。因?yàn)橘|(zhì)控品都是強(qiáng)陽(yáng)性的，這樣就是對(duì)照。在試驗(yàn)后要進(jìn)行工作臺(tái)消毒、紫外線消毒以及清潔加壓器、廢棄物，在第二天要清潔實(shí)驗(yàn)室的地面等，這些都是日常所做的工作，是日常工作的核查點(diǎn)。2.理想的試劑PCR每次遇到結(jié)果不理想的時(shí)候，首先想到試劑盒，理想的試劑對(duì)于檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性是非常重要的。影響試劑盒質(zhì)量的因素包括核酸提取的方法、核酸擴(kuò)增所用到的原材料、探針、DNTP、緩沖液、各種各樣的酶等都是影響試劑盒質(zhì)量的因素。試劑盒運(yùn)輸和保存過程中要注意環(huán)境溫度，核酸擴(kuò)增的試劑是在零下20℃保存的，提取試劑是可以存放到2～8℃的。試劑盒的質(zhì)檢主要是內(nèi)外包裝的檢驗(yàn)，在外包裝上看有沒有生產(chǎn)廠家的姓名、檢測(cè)目的、批準(zhǔn)文號(hào)、批號(hào)、有效期等，別是假冒偽劣的、或者是過期的試劑；在內(nèi)包裝上看完整不完整、有沒有漏液的現(xiàn)象，如果是真空包裝，是不是已經(jīng)被破損了，這些是進(jìn)行包裝上的質(zhì)檢。性能檢驗(yàn)可以通過血清的實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定靈敏度、特異性。試劑盒核酸提取試劑抗干擾能力的檢驗(yàn)，PCR提取實(shí)驗(yàn)的干擾主要是溶血和止血的干擾，血紅蛋白和血脂都是在PCR檢測(cè)當(dāng)中最常見的移植物，所以也進(jìn)行抗干擾能力的檢驗(yàn)。3.檢驗(yàn)前的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序PCR的整個(gè)過程包括標(biāo)本的采集、運(yùn)送、編號(hào)、試劑準(zhǔn)備、核酸提取、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)、結(jié)果分析等環(huán)節(jié)，都應(yīng)該有標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序來(lái)監(jiān)控這些環(huán)節(jié)。做任何環(huán)節(jié)的時(shí)候必須按照SOP來(lái)執(zhí)行，這樣才能保證對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，所以這個(gè)條件也是非常必要的。人員各個(gè)方面的培訓(xùn)都是應(yīng)該做到的，包括這些儀器，PCR實(shí)驗(yàn)室涉及到的儀器也是非常多的，儀器操作有可能都很簡(jiǎn)單，但是都是微量的操作，所以儀器也是非常重要的污染源和防污染的措施，PCR最主要的污染源就是氣溶膠的污染，所以一定防止氣溶膠的污染。措施就是實(shí)驗(yàn)室的嚴(yán)格分區(qū)，物理上防止氣溶膠污染的措施，嚴(yán)格的工作程序?；瘜W(xué)清污的方法，比如、用次氯酸消毒實(shí)驗(yàn)室的臺(tái)面、地面等，還有就是產(chǎn)物的修飾的方法，各種方法達(dá)到最終的目的都是要控制氣溶膠的污染，這樣才能保證檢測(cè)質(zhì)量過關(guān)。（五）檢驗(yàn)程序CNAS有如下兩點(diǎn)要求：（1）臨床用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本宜進(jìn)行抗凝處理，并盡快（3小時(shí)內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則宜在抽血后1小時(shí)內(nèi)分離血清。在臨床上要求抽血后1小時(shí)內(nèi)分離血清，而且不能用生化或者免疫所做的樣本來(lái)進(jìn)行核酸檢測(cè)，就會(huì)出現(xiàn)污染的現(xiàn)象，先做完了提供給他們是可以的，做完了是堅(jiān)決不能給的。不同的實(shí)驗(yàn)室要避免這些現(xiàn)象，因?yàn)槭欠肿由飳?shí)驗(yàn)室或者是生化實(shí)驗(yàn)室，所開的項(xiàng)目，或者是臨床大夫可以抽2管血，這樣就不存在標(biāo)本分注的問題。（2）不宜僅根據(jù)普通電泳的區(qū)帶位置對(duì)區(qū)帶的特異性進(jìn)行診斷。在臨床基因庫(kù)實(shí)驗(yàn)室管理辦法暫行當(dāng)中，是嚴(yán)格禁止用普通電泳的區(qū)帶位置去出臨床報(bào)告的，就是不能用電泳的結(jié)果發(fā)臨床報(bào)告。所以臨床基因庫(kù)實(shí)驗(yàn)室管理辦法的條款比CNAS可能要更嚴(yán)格一些。（六）檢驗(yàn)程序的質(zhì)量控制主要包括室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)。CNAS是從實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制至少需做陰陽(yáng)性質(zhì)控。要求簡(jiǎn)單，在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中，也是定量的方法，做的質(zhì)控包括空白對(duì)照、陰性對(duì)照、弱陽(yáng)性對(duì)照、室內(nèi)質(zhì)控品。然后繪制質(zhì)控圖，PCR實(shí)驗(yàn)室跟其他實(shí)驗(yàn)室不同的地方就是樣本量不會(huì)很大，不能保證每天都進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，繪制質(zhì)控圖不能像其他實(shí)驗(yàn)室那樣去畫質(zhì)控圖，所以用即刻法來(lái)繪制質(zhì)控圖，只要有3點(diǎn)就可以來(lái)檢測(cè)這個(gè)室內(nèi)質(zhì)控是不是在控，等做20次之后就可以用質(zhì)控圖方法來(lái)繪制質(zhì)控，然后再檢測(cè)20次試驗(yàn)來(lái)確定的質(zhì)控是不是在控。定量PCR試驗(yàn)需定期參加CNAS承認(rèn)的能力驗(yàn)證（室間質(zhì)量評(píng)價(jià)），并不光是定量PCR試驗(yàn)，包括定性的PCR試驗(yàn)在衛(wèi)生部要求參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，所以無(wú)論是定量還是定性，只要是分子生物學(xué)的檢測(cè)項(xiàng)目都要參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。（七）檢驗(yàn)后程序檢驗(yàn)結(jié)果的審核，要注意審核的要素一定要做到位，病人的姓名、一些信息是不是符合要求，病人的原始樣本的保存，在自己的實(shí)驗(yàn)室所有的原始樣本都是保存下來(lái)的。因?yàn)闃颖静⒉皇呛芏啵幮院完?yáng)性的樣本。文件上要求樣本保存2～3年，剛做完放在零下20℃保存的，3個(gè)月以后放到零下80℃冰箱進(jìn)行樣本的保存。然后就是廢棄物的處理，主要關(guān)系到生物安全的問題，完全符合臨床基因庫(kù)的實(shí)驗(yàn)室要求，需要怎樣高壓處理、雙層垃圾袋裝，廢棄物出實(shí)驗(yàn)室時(shí)候是不是還要用含氯的消毒液進(jìn)行浸泡，這些都是符合要求的。（八）結(jié)果報(bào)告正常報(bào)告需要大家進(jìn)行核對(duì)、簽字。簽字一定要簽全名，不可以只簽一個(gè)字，造成歧義、誤會(huì)。實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)有一些特殊報(bào)告，電話、傳真、郵寄。但是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室所規(guī)定的報(bào)告形式不包括電話報(bào)告結(jié)果的，可能會(huì)造成一定的麻煩，現(xiàn)在可以用傳真或者是郵寄的方式進(jìn)行匯報(bào)。PCR實(shí)驗(yàn)室記錄法很多，如何找到簡(jiǎn)單的方法保證記錄長(zhǎng)期記錄下去？三、記錄保存與管理實(shí)驗(yàn)室記錄是非常重要的部分，提供的是證據(jù)性文件，是質(zhì)量體系的有機(jī)組成部分。記錄種類包括檢驗(yàn)單、檢驗(yàn)結(jié)果和報(bào)告、儀器打印結(jié)果、檢驗(yàn)過程記錄、實(shí)驗(yàn)室工作記錄、標(biāo)本接收記錄等很多。實(shí)驗(yàn)室記錄一共有35個(gè)表格。PCR實(shí)驗(yàn)室記錄法很多，離心機(jī)、生物安全柜、儀器、儀器的操作要記錄、維護(hù)校準(zhǔn)也要記錄、試劑的來(lái)源批號(hào)也要記錄、樣本來(lái)源、唯一編號(hào)等，同時(shí)試劑的配置、環(huán)境的溫濕度、實(shí)驗(yàn)室的清潔記錄、質(zhì)控記錄、原始記錄都需要記錄。這些記錄初看是非常多的，而且實(shí)驗(yàn)室是有分區(qū)的，所以感覺到難以記錄。這種感覺并不奇怪，要求完整的記錄，上述這些記錄可能需要很多記錄本，很難以持之以恒。要找到簡(jiǎn)單的方法來(lái)進(jìn)行記錄，讓記錄進(jìn)行下去。臨床檢驗(yàn)的特點(diǎn)就是重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)和相同的實(shí)驗(yàn)過程，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)室流程的記錄在一段較長(zhǎng)的時(shí)間當(dāng)中可能是一樣的，除非試劑有很大的更換，記錄也會(huì)有更換。記錄要求完整、有效，所以在每天重復(fù)的工作流程前用□表示，做完后在□內(nèi)劃√即可，這樣就可以堅(jiān)持下來(lái)了。陽(yáng)性樣本室內(nèi)質(zhì)控圖需單獨(dú)繪制，室內(nèi)質(zhì)控有幾種方法，一個(gè)是即可圖的方法，一個(gè)是繪制圖，如有失控發(fā)生要分析原因，盡快去糾正。保存試劑和臨床樣本的冰箱溫度可單獨(dú)記錄或用軟件記錄。圖

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記錄表圖2是一種記錄表格，表格設(shè)計(jì)成這樣的，每天都要做這些工作，重復(fù)這些工作，就把要做的事情用文字表示出來(lái)，前面畫上□，做完了在上面打√。圖

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實(shí)驗(yàn)記錄圖3是實(shí)驗(yàn)記錄的例子，實(shí)驗(yàn)記錄就是把實(shí)驗(yàn)編號(hào)、日期、檢測(cè)人員、檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)方法、試劑的廠家、批號(hào)、儀器的名稱都記錄在上面。室內(nèi)溫度記錄在上面，配試劑、做乙肝、丙肝等把試劑配置的情況寫上面，檢測(cè)所用的方法寫在上面，然后下面的空白區(qū)域可以貼圖。圖4是一種比較簡(jiǎn)單的記錄方式。圖

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記錄說明記錄標(biāo)志就是記錄的名稱、編碼，做記錄每個(gè)記錄應(yīng)該有自己的名稱，記錄都是連接在SOP記錄下面的，編碼也是連接在SOP記錄下面的，這樣便于查找、溯源性比較好。記錄的標(biāo)志要明顯、好記。記錄填寫要求

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一般用筆填寫，也有一些是電子版記錄。簽字筆好些，如果是圓珠筆保存的時(shí)間不會(huì)很長(zhǎng)。要求記錄的原始性、清晰正確，記錄不能弄虛作假，不能后補(bǔ)，后補(bǔ)的記錄沒有意義。清晰、正確、干凈、整潔的，自己去寫。筆誤的處理，如果不小心寫錯(cuò)了，不能亂涂，而且不能用修正液，應(yīng)該在原始表格寫錯(cuò)的地方畫杠，在上面或下面用正確的文字改過來(lái)，而且在改過的地方簽上改動(dòng)人的名字。空白欄目的填寫、核心內(nèi)容填寫，空白欄目表格有一個(gè)備注欄，就怕會(huì)有問題需要寫的時(shí)候，寫在備注欄里面，如果不填應(yīng)該用橫杠或者是寫“無(wú)”字，表示關(guān)注這個(gè)欄了。簽名應(yīng)該是簽全名，不能出現(xiàn)有姓無(wú)名的現(xiàn)象，以后溯源性非常難，所以簽名要簽全名。有的記錄很多頁(yè)，所以要有頁(yè)碼的編寫，頁(yè)碼編寫格式不是統(tǒng)一的，大家用什么樣的格式編寫都是可以的，但是一定要編號(hào)編碼以便查詢。記錄保存的質(zhì)量，防止蟲蛀、鼠咬、發(fā)霉這種情況，保存在安全的地方。記錄保存期限，實(shí)驗(yàn)室的記錄要求保存2年，有些記錄是可以保存2年的，像實(shí)驗(yàn)室清潔記錄、環(huán)境溫濕度的記錄。有些患者信息的記錄、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄也較長(zhǎng)時(shí)間的保存。文獻(xiàn)上寫的是2年，但實(shí)際上在長(zhǎng)期保存這些記錄。過期記錄的處理，尤其是有病人信息的記錄，處理時(shí)不能隨便處理，一定要用粉碎機(jī)進(jìn)行打漿粉碎，或者是銷毀。記錄處理時(shí)，一定要有2個(gè)人員在場(chǎng)，同時(shí)填寫銷毀清單，而且要簽名。電子記錄是實(shí)驗(yàn)室多見的形式，管理上也有優(yōu)勢(shì)，也有缺陷。優(yōu)點(diǎn)非常明顯，歸檔