兩種方法測(cè)定地表水中葉綠素a的比較

兩種方法測(cè)定地表水中葉綠素a的比較康琦【摘要】比較了分光光度法和高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定地表水中葉綠素a的結(jié)果.研究表明:兩種方法的精密度無(wú)顯著差異;葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定結(jié)果也無(wú)顯著差異;在測(cè)定地表水樣品時(shí)，分光光度法測(cè)定結(jié)果高于HPLC法差異主要由664nm波長(zhǎng)下有較強(qiáng)吸收的物質(zhì)造成.分光光度法測(cè)定結(jié)果偏高但操作簡(jiǎn)單川PLC法測(cè)定結(jié)果精準(zhǔn)但操作復(fù)雜，分光光度法在水質(zhì)監(jiān)測(cè)工作中更加具有優(yōu)勢(shì).％Thedeterminationresultsofchlorophyllainsurfacewaterwerecomparedbetweenspectrophotometryandhighperformanceliquidchromatography(HPLC).Thestudyshowedthattherewasnosignificantdifferenceintheprecisionofthetwomethods,aswellasthechlorophyllastandarddeterminationresults.Whenitcametosurfacewatersamples,theresultsofspectrophotometrywerehigherthanthoseofHPLC.Thedifferencewasmainlymadebysubstanceswithstrongabsorptionat664nm.Spectrophotometrywasnotaccuratebuteasytooperate,HPLCwasaccuratebutcomplicated,spectrophotometryhadmoreadvantageinmonitoringwaterquality.【期刊名稱】《廣州化工》【年(卷)，期】2018(046)011【總頁(yè)數(shù)】3頁(yè)(P71-73)【關(guān)鍵詞】地表水葉綠素a;分光光度法;HPLC法【作者】康琦【作者單位】青浦區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，上海201799【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類(lèi)】X832葉綠素a存在于所有浮游植物中，且在一定程度上可以表征浮游植物的生物量［1］。因此，在環(huán)境監(jiān)測(cè)中，葉綠素a的含量是評(píng)價(jià)水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要指標(biāo)之一。近幾年，我國(guó)湖泊（水庫(kù)）富營(yíng)養(yǎng)化形勢(shì)已非常嚴(yán)峻，準(zhǔn)確測(cè)定湖泊中葉綠素a的含量對(duì)于監(jiān)測(cè)水體富營(yíng)養(yǎng)化水平、預(yù)警藻類(lèi)水華有著十分重要的意義。在地表水環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，葉綠素a的測(cè)定方法原本參考《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》［2］。2017年末，國(guó)家環(huán)保部頒布了HJ897-2017［3］（以下簡(jiǎn)稱分光法），并于2018年2月1日正式實(shí)施。美國(guó)早在1997年就頒布了EPA447.0［4］（以下簡(jiǎn)稱HPLC法）。本文將分別以HJ897-2017和EPA447.0測(cè)定地表水樣品中葉綠素a的含量，比較測(cè)定結(jié)果，并討論其差異及優(yōu)缺點(diǎn)。1實(shí)驗(yàn)1.1主要儀器與試劑真空泵；離心機(jī)；UV-2450分光光度計(jì)，島津；1200高效液相色譜儀，Agilent。色譜純丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯;分析純乙酸銨;葉綠素a標(biāo)準(zhǔn),TorontoResearchChemicals公司。1.2水樣來(lái)源水樣均來(lái)自上海某淡水湖，樣品采集后立即加入1%碳酸鎂懸濁液（1L水樣加1%碳酸鎂懸濁液1mL），以防酸化引起色素波長(zhǎng)偏移。1.3.1樣品處理分光法和HPLC法前處理方法相同，具體步驟參照HJ897-2017［3］。1.3.2分光光度法水樣中葉綠素a的濃度(pg/L)計(jì)算公式如下：式中：A664、A647、A630、A750——丙酮提取液在664nm、647nm、630nm、750nm波長(zhǎng)下的吸光度值V取樣——水樣的取樣體積，mL1.3.3HPLC法HPLC儀分析條件固定相為C18反相色譜柱(4.6mmx250mm長(zhǎng)度，5pm孑L徑)，Agilent;柱溫25°C;流動(dòng)相A為甲醇：0.5mol/L乙酸銨水溶液(80:20,V/V);流動(dòng)相B為乙腈:水(90:10,V/V);流動(dòng)相C為乙酸乙酯。具體洗脫程序見(jiàn)表1。每個(gè)樣品30min，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：二極管陣列檢測(cè)器(DAD)440nm。表1HPLC梯度洗脫程序Table1ThegradientelutionprotocolofHPLC時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%流動(dòng)相C/%梯度系統(tǒng)0.010000進(jìn)樣2.001000線性梯度2.609010線性梯度13.606535線性梯度20.003169線性梯度22.001000線性梯度25.010000線性梯度30.010000平衡計(jì)算將1mg市售的葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)樣品溶于100mL90%丙酮中得到葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)中間液，用公式以及葉綠素a的消光系數(shù)［5］標(biāo)定濃度后，控制梯度進(jìn)樣量以建立工作曲線。丙酮提取液經(jīng)HPLC分析后，將葉綠素a的峰面積代入工作曲線，求出質(zhì)量，水樣中葉綠素a的濃度(pg/L)計(jì)算公式如下：式中：m——丙酮提取液中葉綠素a的質(zhì)量，ngV進(jìn)樣——丙酮提取液在HPLC的進(jìn)樣體積，口LV取樣——水樣的取樣體積，mL2結(jié)果2.1HPLC法的標(biāo)準(zhǔn)曲線葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：M=0.938PA-0.0161，R=0.9999式中：m——丙酮提取液中葉綠素a的質(zhì)量，ngPA——峰面積，mAU?s2.2葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定比較葉綠素a標(biāo)樣經(jīng)HPLC分析只檢測(cè)到一個(gè)色譜峰，經(jīng)DAD光譜的吸收峰與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致(如圖1所示)。用該標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)兩種方法進(jìn)行精密度比較(見(jiàn)表2)。經(jīng)F檢驗(yàn)，求得F=3.66，查表得F0.025(5,5)=7.15,F<F0.025(5,5),說(shuō)明兩種方法測(cè)定葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)樣品的精密度無(wú)顯著差異。經(jīng)t檢驗(yàn)，求得t=0.066，查表得t0.05(10)=2.228,t0.20(10)=1.372,t<t0.20(10)<t0.05(10)，說(shuō)明兩種方法測(cè)定葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)樣品的結(jié)果無(wú)顯著差異。圖1葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)樣品液相色譜圖和吸收光譜圖Fig.1ChromatogramandabsorptionspectraofChlastandard表2葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)樣品的重復(fù)測(cè)定Table2RepeateddeterminationofChlastandard方法葉綠素a^度/(pg/L)123456S2F分光法3841.013832.243829.163823.713833.943822.0948.77HPLC法3842.833851.273820.313835.323843.763818.44178.433.662.3地表水樣品測(cè)定比較從圖2可以看出，1號(hào)~6號(hào)樣品濃度較高，7~16號(hào)樣品濃度較低。分光法數(shù)據(jù)均高于HPLC法，兩組數(shù)據(jù)相對(duì)偏差在范圍在7.8%-23.0%，高濃度樣品相對(duì)偏差較小。將兩種方法的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。由圖3可知，兩種方法相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.9973，線性關(guān)系良好。圖2兩種方法測(cè)定結(jié)果的比較Fig.2Comparisonbetweenthedeterminingresultsofthetwomethods圖3兩種方法的相關(guān)性Fig.3Correlationbetweenthetwomethods分別以高、低濃度的2個(gè)樣品作6次重復(fù)測(cè)定（見(jiàn)表3）。經(jīng)F檢驗(yàn)，2組數(shù)據(jù)的F值分別為6.32,1.34，均小于F0.025（5,5）=7.15，說(shuō)明兩種方法測(cè)定地表水樣品的精密度無(wú)顯著差異。表3地表水樣品的重復(fù)測(cè)定Table3Repeateddeterminationofsurfacewatersamples樣品方法葉綠素a^度/（pg/L）123456S2F高濃度分光法106.01106.40106.40106.40106.01106.060.04215HPLC法84.2184.0584.0184.0584.0583.970.0066676.32低濃度分光法9.859.859.859.909.859.900.0006667HPLC法6.546.546.516.546.546.580.00049671.343討論3.1兩種方法的差異原因兩種方法測(cè)定葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)精密度和測(cè)定結(jié)果均無(wú)顯著差異，而測(cè)定地表水樣品時(shí)分光法顯著高于HPLC法。通過(guò)比較地表水樣品中各出峰物質(zhì)與葉綠素a的DAD吸收光譜，可以發(fā)現(xiàn)有些出峰物質(zhì)的吸收光譜與葉綠素a非常相似，在664nm波長(zhǎng)下都有較強(qiáng)的吸收（如圖4）。將這些色素（以下簡(jiǎn)稱總?cè)~綠素a）的峰面積相加求出總濃度與分光法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，從圖5可以看出兩種方法的測(cè)定結(jié)果線性關(guān)系良好，斜率接近1。由此推測(cè)，分光法和HPLC法測(cè)定地表水樣品時(shí)的差異主要是由在664nm波長(zhǎng)下同樣有較強(qiáng)吸收的物質(zhì)弓|入的。這些物質(zhì)可能是葉綠素a的代謝產(chǎn)物（脫植基葉綠素a、脫鎂葉綠素a、脫鎂葉綠酸弧衍生物或同質(zhì)異晶體等等[7-9]。分光法測(cè)定的是表觀葉綠素a，計(jì)算公式只扣除了葉綠素b、c在664nm的干擾[10],而沒(méi)有扣除葉綠素a的代謝產(chǎn)物等色素的干擾；HPLC法則可以把不同色素的峰分開(kāi)，精準(zhǔn)計(jì)算出葉綠素a的濃度。因此，分光法會(huì)把水體中沒(méi)有光合活性的色素含量也引入計(jì)算結(jié)果，導(dǎo)致最終結(jié)果偏高。圖4地表水樣品液相色譜圖和吸收光譜圖Fig.4Chromatogramandabsorptionspectraofasurfacewatersample圖5分光法測(cè)定葉綠素a與HPLC法測(cè)定總?cè)~綠素a結(jié)果相關(guān)性Fig.5CorrelationbetweenthedeterminingresultsofSpectrometryforChlaandHPLCfortotalChla3.2兩種方法的綜合比較本實(shí)驗(yàn)中，兩種方法測(cè)定地表水樣品的結(jié)果線性關(guān)系非常好（圖3）,但如果需要建立兩種方法的關(guān)系模型，還需要分析不同季節(jié)、不同水域的水樣并增加樣本數(shù)量。分光法的測(cè)定結(jié)果因包含了葉綠素a的降解產(chǎn)物等色素濃度而偏高，但它操作過(guò)程簡(jiǎn)單、用時(shí)較短，只需要測(cè)定丙酮提取液的吸光度就可以計(jì)算出葉綠素a的濃度。HPLC法的測(cè)定結(jié)果精準(zhǔn)，但實(shí)驗(yàn)成本較高，操作較復(fù)雜，需要建立工作曲線、配制流動(dòng)相，用時(shí)較長(zhǎng)（一個(gè)樣品需要至少30min），對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求也較高，需要熟練掌握HPLC的使用以及葉綠素a色譜峰的識(shí)別。作為現(xiàn)行的測(cè)定地表水中葉綠素a的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，分光法簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)在水質(zhì)監(jiān)測(cè)工作中具有很大優(yōu)勢(shì)，另外評(píng)價(jià)湖泊（水庫(kù)）營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為不同的濃度區(qū)間，分光法的測(cè)定結(jié)果對(duì)于一個(gè)水域整體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)評(píng)價(jià)結(jié)果的影響不大，必要時(shí)可以用HPLC法的測(cè)定結(jié)果作為參考。4結(jié)論分光法和HPLC法的精密度無(wú)顯著差異；測(cè)定葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)結(jié)果無(wú)顯著差異，測(cè)定地表水樣品時(shí)分光法測(cè)定結(jié)果高于HPLC法。分光法和HPLC法的差異主要是由在664nm波長(zhǎng)下同樣有較強(qiáng)吸收的物質(zhì)引入的，如葉綠素a的代謝產(chǎn)物等等。⑶分光法的測(cè)定結(jié)果偏高但操作簡(jiǎn)單，HPLC法的測(cè)定結(jié)果精準(zhǔn)但操作復(fù)雜。分光法在水質(zhì)監(jiān)測(cè)工作中更加具有優(yōu)勢(shì)，HPLC法可以作為參考。參考文獻(xiàn)杜勝藍(lán)，黃歲糅,臧常娟.等.浮游植物現(xiàn)存量表征指標(biāo)間相關(guān)性研究I：葉綠素a與生物量[J].水資源與水工程學(xué)報(bào),2011,22(1):40-44.國(guó)家環(huán)?？偩?《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì).水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法.4版(增補(bǔ)版)[M].中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2002:722-723.環(huán)境保護(hù)部.HJ897-2017水質(zhì)葉綠素a的測(cè)定分光光度法[S].2017.USEPAMethod447.0,DeterminationofChlorophyllsaandbIdentificationofOtherPigmentsofInterestinMarineandFreshwaterAlgaeUsingHighPerformanceLiquidChromatographywithVisibleWavelengthDetection[S].1997.胡俊，柳欣，王磊，等.應(yīng)用反相高效液相色譜定性和定量浮游植物光合色素[J].海洋科學(xué),2011,35(11):19-28.萬(wàn)修志.提取測(cè)定淡水藻中葉綠素a的方法研究[D].濟(jì)南:山東建筑大學(xué),2011.