酶的化學(xué)修飾

酶的化學(xué)修飾第1頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)什么是酶分子修飾?通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過(guò)人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，或除去酶分子中的某些集團(tuán)，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。第2頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二酶分子的化學(xué)修飾穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)條件的需要。作用的最適條件不符。酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。臨床應(yīng)用的特殊要求。酶在應(yīng)用中可能出現(xiàn)的問(wèn)題:第3頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二酶分子改造的方向核酸水平：利用基因操作技術(shù)對(duì)DNA或mRNA進(jìn)行改造或修飾，以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)（一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)）更為合理的酶?！锩腹こ虄?nèi)容之一蛋白質(zhì)水平：人們用化學(xué)法或酶法對(duì)酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，這包括酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸的置換，包括用酶將肽鏈切斷或部分切除，使酶的空間構(gòu)象變得更為穩(wěn)定。另一方面是對(duì)酶分子中氨基酸殘基的修飾，即酶的化學(xué)修飾。第4頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二酶分子的化學(xué)修飾定義：廣義上說(shuō)：凡涉及共價(jià)鍵的形成或破壞的轉(zhuǎn)變都可以看作是酶的化學(xué)修飾。狹義上說(shuō)：是指在較溫和的條件下，以可控制的方式使酶同化學(xué)試劑發(fā)生特異反應(yīng)，從而引起單個(gè)氨基酸殘基或功能發(fā)生共價(jià)的化學(xué)變化。第5頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二酶化學(xué)修飾的目的1.研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（50年代末）2.人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。3）消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能力）。4）產(chǎn)生新的催化能力。第6頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第二節(jié).酶化學(xué)修飾的基本原理*1．如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性2．如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑3．如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶4．如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境第7頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二酶化學(xué)修飾的原理一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。第8頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶化學(xué)修飾后通過(guò)兩種途徑抗蛋白水解酶：大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2.酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。第9頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1.酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除

“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結(jié)合2.大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。第10頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)酶化學(xué)修飾的基本要求和條件

一．修飾劑的要求二．酶性質(zhì)的了解三．反應(yīng)條件的選擇四．酶修飾方法第11頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一．修飾劑的要求1．修飾劑具有較大的相對(duì)分子量；對(duì)蛋白質(zhì)的吸附有良好的生物相容性和水溶性。2．修飾劑分子表面具有較多的活性反應(yīng)基團(tuán)。3．修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件。第12頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

了解被修飾酶的性質(zhì)酶的穩(wěn)定性：包括熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，作用溫度以及pH，酶蛋白解離時(shí)的電化學(xué)性質(zhì)，抑制劑的性質(zhì)等。酶活性中心的狀況：包括酶分子活性中心的組成，如參與活性中心的氨基酸殘基、輔因子等。酶分子的形狀、大小以及寡聚酶的亞基組成。二.酶化學(xué)修飾的基本要求第13頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二①pH與離子強(qiáng)度：

一般在酶穩(wěn)定的條件下進(jìn)行，盡可能減少破壞酶的必需集團(tuán)，選擇酶與修飾劑的結(jié)合率和酶活回收率都較高的反應(yīng)條件。

pH決定了酶分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)，酶的解離狀態(tài)不同，其反應(yīng)性能也不同；另一方面，有些修飾試劑在不同pH下，與同一種基團(tuán)反應(yīng)可以形成不同的產(chǎn)物。離子強(qiáng)度對(duì)修飾反應(yīng)也有重要影響。②修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間：嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時(shí)間可以減少或消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。③反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例：酶與修飾試劑的比例可以控制酶分子的修飾程度。三、選擇修飾反應(yīng)條件第14頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(1)酶的表面修飾(2)酶分子的內(nèi)部修飾(3)與輔因子相關(guān)的修飾(4)金屬酶的金屬取代第四節(jié).酶分子的化學(xué)修飾方法*第15頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二⑦反相膠團(tuán)微囊化⑥脂質(zhì)體包埋⑤分子間交聯(lián)④分子內(nèi)交聯(lián)③酶的大分子修飾作用②酶的小分子修飾作用①化學(xué)固定化(1)酶的表面修飾第16頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（1）酶的表面修飾①化學(xué)固定化：一般是直接通過(guò)酶表面的氨基酸殘基將酶分子共價(jià)連接到惰性載體上；由于載體的引入，使酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而改變了酶的性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。第17頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二②酶的小分子修飾作用：主要是利用一些小分子修飾試劑，通過(guò)共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾酶的一些基團(tuán)（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高酶的穩(wěn)定性。常用的小分子修飾試劑有乙基、糖基和甲基等。例如:將α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修飾后，酶的熱穩(wěn)定性在60℃時(shí)，提高了1000倍，溫度更高時(shí)穩(wěn)定化效應(yīng)更強(qiáng)烈。這個(gè)穩(wěn)定的酶能經(jīng)受滅菌的極端條件而不失活，因而有利于醫(yī)療用酶。第18頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二③酶的大分子修飾作用：可分為非共價(jià)修飾和共價(jià)修飾兩大類：大分子非共價(jià)修飾：大分子共價(jià)修飾：第19頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二大分子非共價(jià)修飾：利用一些大分子試劑通過(guò)與酶非共價(jià)相互作用，對(duì)酶進(jìn)行有效的保護(hù)。例如聚乙二醇、右旋糖苷等通過(guò)氫鍵固定于酶分子的表面，同時(shí)又有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過(guò)調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來(lái)保護(hù)酶活力；另外一些蛋白質(zhì)可以通過(guò)相互作用，排除分子表面的水分子，降低介電常數(shù)，使酶的穩(wěn)定性增加。第20頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二大分子共價(jià)修飾：利用一些可溶性大分子，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許多有用的性質(zhì)。例如用聚乙二醇共價(jià)修飾超氧化物歧化酶（SOD），不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了半衰期，從而提高了藥效。第21頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二大分子（共價(jià)）修飾的過(guò)程①修飾劑的選擇根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。②修飾劑的活化修飾劑中含有的基團(tuán)需要經(jīng)過(guò)活化才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。

第22頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二③修飾將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過(guò)分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。④分離需要通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開(kāi)，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。第23頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二④分子內(nèi)交聯(lián)：

增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基經(jīng)過(guò)羰二亞胺活化后，可以與一系列二胺發(fā)生作用，使酶的穩(wěn)定性得到改善。第24頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二⑤分子間交聯(lián)：

利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶交聯(lián)在一起形成雜化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交聯(lián)在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；將胰蛋白酶與堿性磷酸脂酶交聯(lián)形成的雜化酶可作為部分代謝途徑的模型。第25頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二⑥脂質(zhì)體包埋：一些醫(yī)藥用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量較大，不易進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，而且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)；用脂質(zhì)體包埋法即可解決這些問(wèn)題。

脂質(zhì)體是天然脂類或類固醇組成的微球體，酶分子包埋在其內(nèi)部，可以通過(guò)與細(xì)胞的膜融合或內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。第26頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二⑦反相膠團(tuán)微囊化：這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酶在有劑相中進(jìn)行催化的技術(shù)，反相膠團(tuán)中酶的穩(wěn)定性大大提高；一些表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中時(shí)可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團(tuán)，反相膠團(tuán)是表面活性劑的疏水尾部朝外而極性頭部朝內(nèi)的微膠團(tuán)，其內(nèi)部可容納一定量的水，酶溶解在其中避免變性（見(jiàn)圖）。第27頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二有機(jī)溶劑

疏水尾部

親水頭部

加酶液

S

PEEE

圖：反相膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)和酶的分布第28頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(1)酶的表面修飾(2)酶分子的內(nèi)部修飾(3)與輔因子相關(guān)的修飾(4)金屬酶的金屬取代酶分子的化學(xué)修飾方法第29頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(2)酶分子的內(nèi)部修飾

①非催化活性基團(tuán)的修飾：

通過(guò)對(duì)非催化殘基的修飾可以改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的親和力；通?？杀恍揎椀陌被釟埢瓤梢允怯H核的，也可以是親電子的，還可以是可氧化殘基。第30頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二②催化活性基團(tuán)的修飾：通過(guò)選擇性修飾催化活性氨基酸的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種氨基酸側(cè)鏈，這種方法又稱為化學(xué)突變法。③酶蛋白主鏈的修飾：主要是靠酶法進(jìn)行修飾，用蛋白酶對(duì)主鏈進(jìn)行部分水解，可以改變酶的催化特性。④肽鏈伸展后的修飾：酶蛋白經(jīng)過(guò)脲、鹽酸胍處理，使肽鏈充分伸展，對(duì)酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修飾，然后在適當(dāng)條件下，重新進(jìn)行折疊。第31頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(1)酶的表面修飾(2)酶分子的內(nèi)部修飾(3)與輔因子相關(guān)的修飾(4)金屬酶的金屬取代酶分子的化學(xué)修飾方法第32頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(3)與輔因子相關(guān)的修飾

對(duì)依賴輔因子的酶可用兩種方法進(jìn)行修飾：如果輔因子與酶是非共價(jià)結(jié)合的,可以將輔因子共價(jià)結(jié)合于酶分子上；引入新的具有更強(qiáng)反應(yīng)的輔因子。第33頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(1)酶的表面修飾(2)酶分子的內(nèi)部修飾(3)與輔因子相關(guān)的修飾(4)金屬酶的金屬取代酶分子的化學(xué)修飾方法第34頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(4)金屬酶的金屬取代：

把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法。適用范圍：只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)本來(lái)含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。第35頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會(huì)喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。第36頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二金屬B金屬離子置換修飾的過(guò)程①酶的分離純化②除去原有的金屬離子③加入置換離子發(fā)酵液酶分離純化A酶EDTAEDTA-A+酶B第37頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第五節(jié)*修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)一．熱穩(wěn)定性二．抗原性三．對(duì)各類失活因子的抵抗力四．體內(nèi)半衰期五．最適pH六．Km的變化:第38頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二修飾酶的化學(xué)性質(zhì)（１）熱穩(wěn)定性：

一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的酶，熱穩(wěn)定性有較大的提高。主要是由于修飾試劑的多個(gè)功能基團(tuán)與酶分子的多個(gè)功能基團(tuán)相互交聯(lián)增加了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性。第39頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較

酶

修飾劑

修飾酶

天然酶

處理?xiàng)l件(℃/時(shí)間)

殘留酶活(%)酰苷脫氫酶

胰蛋白酶

過(guò)氧化氫酶

溶菌酶

尿激酶糜蛋白酶

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

人血清白蛋白

肝素

37/100min

100/30min

50/10min

100/30min

37/48h

37/24h

70

100

46

64

40

90

20

99

80

0

95

50第40頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二．抗原性（２）抗原性：修飾酶的抗原性與修飾劑有關(guān)，目前比較公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果較好。第41頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二酶L-Asn酶SOD酶Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脫氫酶Arg酶過(guò)氧化氫酶胰蛋白酶抗原性修飾劑-葡萄糖苷酶核糖核酸酶酶PEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-Ala消除消除消除消除消除消除消除降低降低消除修飾酶的抗原性變化第42頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三.對(duì)各類失活因子的抵抗力:

化學(xué)修飾酶與天然酶相比，對(duì)蛋白酶、抑制劑等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高。第43頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較酶抗抑制劑抗蛋白酶修飾劑抗失活劑過(guò)氧化氫酶核糖核酸酶溶菌酶胰蛋白酶-葡萄糖苷酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白右旋糖苷抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗SDS抗大豆抑制劑抗胃蛋白酶抗胎盤抑制劑——抗尿素抗SDS第44頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四.修飾酶在體內(nèi)的半衰期：多數(shù)修飾酶在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。第45頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期二天然酶與修飾酶的半衰期比較酶羧肽酶Arg酶Gln-Asn酶尿酸酶超氧化物岐化酶過(guò)氧化氫酶修飾劑半衰期天然酶修飾酶白蛋白白蛋白糖肽右旋糖苷右旋糖苷PEG3.5h17h1.4h1h4h6min6h12h8h20h4h8h第46頁(yè)，共52頁(yè)，2