酵母RNA的提取鑒定和定量測定實驗十

酵母RNA的提取鑒定和定量測定實驗十第1頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三實驗目的

1、學習RNA提取的幾種常用方法并掌握濃鹽法提取RNA的原理和方法。

3、掌握幾種定性鑒定所得RNA的原理與方法。

4、掌握兩種定量測定所得RNA的原理和方法。

5、學習電泳技術的基本原理及其分類以及相關的應用。

第2頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三Ⅰ提純部分濃鹽法提取酵母RNAⅡ定性鑒定部分一、RNA基團鑒定二、電泳分離鑒定三、光譜鑒定四、純度鑒定Ⅲ定量測定部分一、地衣酚法定量測定二、紫外吸收法定量測定實驗內容第3頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三RNA提取和定性定量分析RNA的提取RNA定性分析RNA定量測定第4頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三第5頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三生物大分子物質提取的基本原理與步驟一、材料選擇與處理二、細胞破碎三、細胞器分離四、提取五、純化六、濃縮、干燥七、樣品保存八、定性鑒定九、定量測定10、物質的利用第6頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三核酸的分布DNA：細胞核（95%）細胞器（5%）

RNA：細胞質（75%)

細胞核(10%)

細胞器(15%)RNA以rRNA的數量最多（80％-85%)第7頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三核酸提取的主要步驟破碎細胞去除與核酸結合的蛋白質以及多糖、脂類等生物大分子去除其它不需要的核酸分子沉淀核酸，去除鹽類，有機溶劑等雜質第8頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三核酸分離純化原則保證核酸一級結構的完整性排除其它分子的污染

簡化操作，縮短時間，以減少各種有害因素對核酸的破壞減少化學因素對核酸的降解(pH4-10)減少物理因素對核酸的降解(機械剪切力、高溫)防止核酸的生物降解(DNA酶、RNA酶)

第9頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三實驗原理

由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實驗室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中，DNA和蛋白質則留在苯酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法能較好地除去DNA和蛋白質，提取的RNA具有生物活性。

酵母細胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體的2.67%-10.0%，而DNA含量較少，僅為0.03%-0.516%。為此提取RNA多以酵母為原料。工業(yè)上制備RNA多選用低成本、適于大規(guī)模操作的稀堿法或濃鹽法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備單核苷酸的原料，其工藝比較簡單。第10頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

稀堿法是用氫氧化鈉使酵母細胞壁變性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白質和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調pH2.5利用等電點沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。

濃鹽法是用高濃度鹽溶液處理，同時加熱，以改變細胞壁的通透性，使核酸從細胞內釋放出來。第11頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三RNA提取方法方法與分類稀堿法(0.2%NaOH)濃鹽法(10%NaCl)苯酚法氯仿-異戊醇法去污劑法鹽酸胍法第12頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三三、試劑和器材

1、試劑（1）干酵母粉（2）RNA標準溶液（100微克/毫升）（8）5%硝酸銀溶液（9）鉬酸銨試劑2克鉬酸銨溶解在100毫升10%硫酸中。（10）地衣酚試劑：100毫升濃鹽酸加入100毫克三氯化鐵，搖勻，貯存?zhèn)溆?，使用前加?00毫克地衣酚。（11）NaCl（12）95%乙醇（13）6mol/lHCl（14）高氯酸（15）氯化鋰（16）硼酸緩沖液（pH-3.5）（17）磷酸緩沖液（pH-7.5）第13頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三2、器材

（1）電子天平（2）電熱套（3）三角燒瓶（4）燒杯（5）高速冷凍離心機（6）滴管

（7）抽濾瓶（8）離心管（9）恒溫水浴箱

（10）吸量管（11）紫外分光光度計

（12）表面皿（13）量筒(14）容量瓶（15）擦鏡紙（16）比色皿（17）玻棒（18）定量濾紙（19）試管

（20）布氏漏斗（21）真空泵（22）電泳儀（23）紫外檢測儀（24）可見光分光光度計（25）托盤天平（26）電泳槽(27)0.5-5.0精密pH試紙第14頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

四、實驗方法

RNA的提取的操作

第15頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三3、RNA提取方法(濃鹽法)

提取方案：①取12g活性干酵母,置150ml錐形瓶中，加入60ml蒸餾水，混勻；

②倒入7gNaCl，溶解后，沸水浴1h；

③3500rpm離心8min，將上清倒入50ml燒杯中，

4)用HCl調節(jié)pH，至2.0～2.5；

第16頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三④將燒杯冰浴10min；⑤將燒杯中物質（含沉淀）移入離心管中，3500rpm離心8min，棄上清，將沉淀移入10ml燒杯中，95%乙醇5～10ml洗滌⑥用布氏漏斗真空抽濾⑧干燥，稱重，計算提取率（并保存好RNA）第17頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三思考題

1、簡述生物大分子物質提取和純化的一般步驟。2、RNA提取過程中的關鍵步驟及注意事項有哪些？3、簡述濃鹽法提取RNA過程中的關鍵步驟及注意事項。第18頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三RNA含量測定之一：地衣酚法

第19頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三RNA的地衣酚法定量測定原理

RNA含量測定之一：地衣酚法測定。反應原理：當RNA與濃鹽酸共熱時，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉變成糠醛，后者與3，5-二羥基甲苯（地衣酚

orcinol）反應，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鮮綠色復合物。反應產物在670nm處有最大吸收。RNA濃度在20-250μg/ml范圍內，光密度與RNA濃度成正比。第20頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三λmax=670nmA、核糖鑒定：RNAH2SO4100℃第21頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三（1）標準曲線的制作

取6支試管，7按下表編號及加入試劑，加畢混勻，置沸水浴中加熱45min，取出冷卻，于670nm波長處測定光密度值。

管號試劑012345標準RNA溶液（ml）(100g/ml)00.40.81.21.62.0蒸餾水（ml）2.01.61.20.80.40地衣酚試劑（ml）2.02.02.02.02.02.0第22頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三（2）樣品的測定準確稱取0.1g提取的酵母RNA，放入小燒杯中，加少量蒸餾水調成糊狀，溶解，若不溶，則滴入少量5%-6%氨水助溶，調pH至7.0，小心轉移到25ml容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，混勻。取1.0ml樣品液稀釋40倍后，分別取2份2.0ml的稀釋液，加入2.0ml的地衣酚試劑，混勻，與標準曲線的各管同時置沸水浴中加熱45分鐘，冷卻，測定O.D670。第23頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三（3）RNA含量的計算根據測得的O.D值，從標準曲線上查出相對應的RNA含量，按下式計算出制品中RNA的百分含量：RNA%=第24頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三RNA鑒定之一：組成基團的鑒定第25頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三RNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸組分，加硫酸煮沸可使其水解，用硝酸銀、地衣酚和定磷試劑可分別鑒定嘌呤堿、核糖和磷酸組分。

A、嘌呤鑒定：嘌呤

嘌呤銀化物（白色或紅棕色）AgNO3RNAH2SO4100℃第26頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三實驗步驟:取適量0.05g提取的RNA，加10%硫酸液3ml，放在沸水浴中加熱5分鐘，制成RNA水解，做以下鑒定（1）嘌呤堿基的檢查

取水解液0.5ml，加氨水0.5ml及5%硝酸銀溶液0.3ml，觀察是否產生絮狀嘌呤銀化合物（有時絮狀物出現較慢，可放置十幾分鐘）。

第27頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三第28頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三（2）磷酸的檢查

取水解液0.5ml，加2滴濃硝酸酸化，再加入0.5ml鉬酸銨試劑，放在沸水浴中加熱10分鐘，冷卻靜置后觀察是否有黃色磷鉬酸銨沉淀產生。

（3）核糖的檢查

取水解液0.5ml，加地衣酚試劑0.5ml，放在沸水浴中加熱5分鐘，觀察溶液顏色變化。第29頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三操作方法

用分析天平準確稱取待測的樣品RNA0.150g，加入少量的蒸餾水調成糊狀，再加入少量的水稀釋。用5%---6%的氨水調至pH值為7.0，定容到10ml(RNA的鑒定三和四皆用該溶液,不過要稀釋200倍)。

RNA的定量分析之二：

紫外吸收法測定核酸濃度

第30頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

取兩支離心管，向第一支管中加入2ml樣品溶液和2ml蒸餾水。第二支管中加入2ml樣品溶液和2ml沉淀劑?；靹颉Ｔ诒≈蟹胖?0分鐘，然后離心10分鐘，3000轉/分鐘。從各管中取出0.25ml上清液，用蒸餾水定容到25ml。于260nm處測定其光吸收值（OD1、OD2）第31頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

將樣品放于紫外分光光度計上測定260nm,

計算核酸濃度。

OD1—OD2

RNA%=

0.022

×100

樣品濃度

式中：OD260為260nm波長處光密度讀數；L為比色杯的厚度；0.022為每毫升溶液內含

1微克RNA的光密度。第32頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三RNA的鑒定三：提取的RNA吸收光譜測定

核酸在240~290nm的紫外波段有一強烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不同的核酸有不同的吸收特征。所以可以用紫外分光光度計加以定性和定量。

操作:取RNA的定量分析之二所配溶液0.5ml,稀釋200倍,取3ml測定不同波長(230、240、250260、270、280、290、300、310nm)下的OD值,以不同波長為橫坐標,OD值為縱坐標繪制RNA吸收光譜曲線。第33頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三RNA的鑒定四：提取的RNA純度的判斷

純DNA的OD260/OD280應大于1.8，而純RNA的OD260/OD280應達到2.0。如果樣品中含又雜蛋白、苯酚，則OD260/OD280的比值會明顯降低。所以我們通過測定OD260/OD280的比值來檢測RNA的純度。

操作:

取RNA的定量分析之二所配溶液0.5ml,稀釋200倍,取3ml于比色皿中分別在260nm、280nm處測定其光吸收值（OD1、OD2）根據測得的OD值判斷提取的RNA的純度。第34頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

劑i]

1、推入黑體遮光預熱2、在“T”位置調“0”3、在“T”位置調

“100”4、按到“A”位置測定UV-2000第35頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

RNA的鑒定之二：

醋酸纖維素薄膜電泳分離鑒定

第36頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

1、RNA的堿水解：稱取0.15克RNA，溶于5mL0.3mol/L氫氧化鉀溶液中，使RNA的濃度達到20-30mg/ml。沸水浴30min

或者在37℃水解18個小時。將水解液轉移到椎形瓶中。冰浴中用高氯酸溶液將水解液滴定到pH3.5。2000r/min離心10min，上清液即是樣品液。第37頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三２、準備與點樣(1)將薄膜切成2.5cm×8cm的小片。在薄膜無光澤面(正面)的一端約2cm處用硬鉛筆劃一點樣線。(2)將薄膜無光澤面向下，置PH3.5,0.02mol/L的檸檬酸緩沖液中浸濕。第38頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三(3)將充分浸透的膜條取出，用濾紙吸去多余的緩沖液，把膜條置潔凈玻璃板上，無光澤面朝上。用點樣器在距膜條一