轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與生物反應(yīng)器

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與生物反應(yīng)器第1頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二將特定的目的基因從某一生物體分離出來(lái)，進(jìn)行擴(kuò)增和加工，再導(dǎo)入另一動(dòng)物的早期胚胎細(xì)胞中，使其整合到宿主動(dòng)物的染色體上，在動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，并通過(guò)生殖細(xì)胞傳給后代。這種在基因組中穩(wěn)定整合有人工導(dǎo)入外源基因的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgeneticanimal）。引言第2頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1.轉(zhuǎn)基因牛①?gòu)耐涝讏?chǎng)殺掉的奶牛體內(nèi)收集卵母細(xì)胞，并使之在體外成熟⑦用公牛精液對(duì)成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精；②受精卵離心，濃縮卵黃；④將欲導(dǎo)入的DNA微注射到當(dāng)前核中；⑤對(duì)胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)；⑥利用非外科移植術(shù)將一個(gè)胚胎植入發(fā)情的代孕母牛子宮內(nèi)；⑦對(duì)子代進(jìn)行DNA檢測(cè)，確定是否存在轉(zhuǎn)入基因。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究現(xiàn)狀第3頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第4頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.轉(zhuǎn)基因綿羊、山羊和豬囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子第5頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二在山羊奶中生產(chǎn)ATT第6頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.轉(zhuǎn)基因禽類第7頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4.轉(zhuǎn)基因魚第8頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二將克隆的外源基因注射到一個(gè)受精卵的細(xì)胞核中；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發(fā)育；移植后的受精卵發(fā)育生長(zhǎng)為后代，其中的部分后代其細(xì)胞中都攜帶有轉(zhuǎn)入的外源基因；利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動(dòng)物作為種畜或種禽，培育新的純合系。第9頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二外源目的基因的制備外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)路線第10頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二9.1目的基因的制備9.1.1目的基因的來(lái)源9.1.2目的基因的克隆9.1.3目的基因的轉(zhuǎn)移第11頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二9.1.1目的基因的來(lái)源采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取目的基因；通過(guò)mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增特定基因片段。第12頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二9.1.2目的基因的克隆通過(guò)載體在適當(dāng)?shù)乃拗髦锌寺∵x擇載體目的基因與載體的連接重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞通過(guò)PCR反應(yīng)克隆目的基因第13頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二9.1.3目的基因的轉(zhuǎn)移電穿孔法顯微注射法裸露DNA直接注射磷酸鈣—DNA共沉淀法脂質(zhì)載體包埋法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法第14頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二A.電穿孔法

實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移利用脈沖電場(chǎng)提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。此法簡(jiǎn)單、效率較高，廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。第15頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)B.利用顯微操作技術(shù)轉(zhuǎn)移外源基因的方法。

此法轉(zhuǎn)入基因長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)百kb；并能隨機(jī)地整合在受體細(xì)胞染色體DNA上，因此應(yīng)用范圍廣。但是這種整合有時(shí)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組的重排、易位、缺失或定點(diǎn)突變。第16頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二C.磷酸鈣—DNA共沉淀法這種方法是受二價(jià)金屬離子能促進(jìn)細(xì)胞吸收外源DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來(lái)的。當(dāng)核酸以磷酸鈣—DNA共沉淀物的形式在時(shí)，細(xì)胞攝取DNA的能力顯著加強(qiáng)。但轉(zhuǎn)移效率較低，僅有1%~5%的外源DNA可以進(jìn)入受體細(xì)胞核中，大約僅有1%的DNA可以在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。第17頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二D.脂質(zhì)載體包埋法將需要轉(zhuǎn)移的外源DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，由于脂質(zhì)體具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜類似，因此可以與受體細(xì)胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。這種方法轉(zhuǎn)基因效率高。第18頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法第19頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二9.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育技術(shù)基因顯微注射法胚胎干細(xì)胞移植法反轉(zhuǎn)錄病毒法精子載體導(dǎo)入法YAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移細(xì)胞核移植技術(shù)第20頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二何為顯微注射？顯微注射就是借助光學(xué)顯微鏡的放大作用，利用顯微操作儀，直接把DNA注射到動(dòng)物早期胚胎、胚胎干細(xì)胞、體細(xì)胞或卵母細(xì)胞中，然后生產(chǎn)動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)。經(jīng)過(guò)顯微注射DNA發(fā)育而成的動(dòng)物中，有少數(shù)整合了被注射的DNA分子，成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。9.2.1基因顯微注射法第21頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二通過(guò)激素療法使小鼠超數(shù)排卵，開始時(shí)注射雌性妊娠血清，48小時(shí)后再注射人絨毛膜促性腺激素，這時(shí)小鼠便會(huì)超數(shù)排卵，一般情況下5-10個(gè)，超數(shù)排卵為35個(gè)；與雄性小鼠交配，然后殺掉小鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；將經(jīng)純化的轉(zhuǎn)基因樣品迅速注射入受精卵中變大的雄性原核內(nèi)；DNA顯微注射法的基本程序第22頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二將25-40個(gè)注射了轉(zhuǎn)基因的受精卵移植入代孕小鼠體內(nèi)；受精卵發(fā)育成胚胎，并繁殖成轉(zhuǎn)基因小鼠子代；從小鼠子代體內(nèi)取出DNA樣品進(jìn)行雜交，鑒定轉(zhuǎn)基因的整合與否及位點(diǎn)；子代小鼠間進(jìn)行再交配，繁殖，觀察轉(zhuǎn)基因是否遺傳及表達(dá)。第23頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二通過(guò)DNA顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因小鼠示意圖第24頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1.顯微注射DNA的制備與純化DNA構(gòu)型和末端結(jié)構(gòu)載體DNA的長(zhǎng)度與濃度溶解DNA的緩沖液DNA的純度第25頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.鼠的準(zhǔn)備與要求轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)所用各類鼠第26頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.超排卵與取卵孕馬血清（PMS）其有效成分為卵泡刺激素（FSH）。人絨毛膜促性腺激素（hGG）雌鼠的排卵時(shí)間：PM10.00~12.00雄鼠的排精時(shí)間：PM10.00~12.00受精一般發(fā)生在：AM1.00超排卵第27頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二制定排卵程序：(1)于第一日中午先向小鼠腹腔內(nèi)注入5一l0單位的PMS；(2)過(guò)48小時(shí)(第三天中午)腹腔內(nèi)注入5—10單位的人hCG(注射后11—13小時(shí)后排卵)；(3)令雌雄動(dòng)物一對(duì)一的合籠交配；動(dòng)物半夜交尾，如未發(fā)生交配，兩周后可再重用，但成功率下降；(4)檢查陰栓(第四日晨)；檢查陰栓可判定是否受精；如已受精則出現(xiàn)陰栓。第28頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2受精卵的收集(1)檢查陰栓：有白色陰栓的小鼠可用，引頸處死動(dòng)物：(2)取輸卵管：剖開腹腔取出輸卵管，置入含有3ml培養(yǎng)液的60mm直徑的瓶皿中；(3)取卵子；在20×或50×解剖鏡下找到輸卵管，在卵管膨大的壺腹部(于卵管開口近處)隱約可見內(nèi)含的胚卵，把胚卵團(tuán)用尖攝輕輕壓擠出，用吸管移入含有400l分離液的表玻皿中；第29頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(4)另準(zhǔn)備4—5個(gè)平皿，每皿內(nèi)均充有胚胎培養(yǎng)基400l并覆蓋有厚8mm硅烷油或液體石蠟層(Fisher產(chǎn)，研究用)，硅烷油和石蠟巳預(yù)先在5%CO2中置37℃1小時(shí)做平衡處理。覆硅烷油或石蠟層的目的是為防止培養(yǎng)液蒸發(fā)、散熱和pH改變；第30頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(5)向含卵團(tuán)表玻皿的分離液中加5l新制備的透明質(zhì)酸酶(透明質(zhì)酸酶10mg／1ml分離液，Sigma產(chǎn))，把胚卵團(tuán)消化分散開；(6)當(dāng)卵團(tuán)散開后，立即把分散游離的卵細(xì)胞用吸管轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)皿中，通過(guò)硅油層接種入任一培養(yǎng)液小滴中)，以清除酶的繼續(xù)作用；(7)再依次通過(guò)皿內(nèi)其余培養(yǎng)液小滴，以繼續(xù)除掉酶和擺脫碎片(碎片能堵塞吸管口)，此時(shí)的卵己可用作DNA注射之用。第31頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4.DNA顯微注射1）制備持卵管與注射針持卵管制備：在火焰燈上將微玻璃管拉成中間較細(xì)的約5~10cm長(zhǎng)的一段，其口徑約80~120m，用玻璃刀將其在離頸部2cm處切斷，再把切口燒成如圖形狀，口徑約15m。將尖部移近火焰噴燈略加熱，用鑷子輕觸尖部適宜位置，使變成如圖所示角度。注射針的制備：由拉針器制成，針的口徑應(yīng)低于1m。第32頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第33頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（1）硅烷油注入：取培養(yǎng)皿或表玻皿，注入已經(jīng)過(guò)平衡處理過(guò)的液體硅烷油或石蠟（厚約5mm）；（2）加培養(yǎng)基：通過(guò)硅烷油或石蠟層向培養(yǎng)皿底接種培養(yǎng)液，以100l為單元的小滴數(shù)個(gè)，各滴間相距1一2cm(視小滴多少而定)；（3）胚卵接種：吸取待受注射胚卵數(shù)個(gè)，通過(guò)油層分別接種入培養(yǎng)液小滴中；2DNA注射第34頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（4）DNA準(zhǔn)備：從Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥，重懸于注射緩沖液中(含1mgDNA／ml)，使其最終濃度為：0.05~0.5mg/ml（5）于臨注射前把DNA樣品在Eppendorf管中再離心一次(1200rpm，10分鐘)，以消除末溶解物，防止阻塞注射管口；（6）把待注射用的DNA裝入注射管中；第35頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（7）在顯微鏡下把支持吸管轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液小滴中，選一健康胚卵；先吸少量培養(yǎng)液，僅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持負(fù)壓狀態(tài)下吸住胚卵，繼之把支持管調(diào)至皿底令胚卵靠于皿底面中央部；（8）調(diào)注射針至胚卵近處，先調(diào)顯微鏡焦點(diǎn)看清針尖，然后通過(guò)透明帶刺入胚卵細(xì)胞膜內(nèi)(小鼠胚卵直徑約10m)，進(jìn)而繼續(xù)進(jìn)針再刺入任一原核內(nèi)（雄性原核多位于周邊部，體積較大，為主要注射對(duì)象）。注射針刺入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行注射時(shí)，如細(xì)胞核微微發(fā)生膨脹，證明DNA已被注入，反之需重新進(jìn)行注射；注射細(xì)胞數(shù)量越多越好；第36頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（9）用支持吸管把已注射細(xì)胞移入另一培養(yǎng)小滴中，使之與未注射細(xì)胞分開；待注射結(jié)束后，把所有細(xì)胞均移入培養(yǎng)液中，置入溫箱培養(yǎng)30分種；（10）鏡下觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有溶解死亡崩潰者棄掉。第37頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第38頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二5.體內(nèi)接種（1）在手術(shù)前夜令受體母鼠與已結(jié)扎輸精管雄性小鼠合籠，次日晨取出雌鼠備用；（2）取注射吸管兩支，分別作為向兩側(cè)輸卵管注入胚卵之用；先吸入少許培養(yǎng)液，排出后留少許液體并保留一兩個(gè)氣泡，繼之吸入胚卵數(shù)個(gè)(在管腔內(nèi)成串)；最后仍保留一個(gè)氣泡，以使管內(nèi)胚卵限制于氣泡之間不易移動(dòng)并利于識(shí)別；第39頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（3）麻醉小鼠，深度適當(dāng)，置動(dòng)物于小手術(shù)平臺(tái)上，呈腹臥位(背朝上)；（4）剪出背腎部?jī)蓚?cè)毛，碘酒／酒精消毒；（5）使動(dòng)物軀干部一側(cè)斜向上，在髂骨和腎臟下方間剪一縱切口，長(zhǎng)2cm；（6）輕輕牽出輸卵管，找尋輸卵管口(剛排卵動(dòng)物輸卵管壺腹部微膨脹，內(nèi)可見成團(tuán)未受精卵子)一手用鑷子輕輕持住輸卵管系膜，另一只手持一個(gè)含有胚卵的注入管，伸入輸卵管口內(nèi)，把吸管內(nèi)已含有外源DNA的胚卵全部注入輸卵管內(nèi)；第40頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（7）把輸卵管及周圍組織送回腹腔內(nèi)；（8）仔細(xì)緊密縫合創(chuàng)口，（9）再令動(dòng)物倒向另側(cè)；按同樣操作方法向該側(cè)輸卵管內(nèi)輸入同等量的胚卵。第41頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第42頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二6.顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因鼠的成活率第43頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)基因范圍廣，轉(zhuǎn)移基因大，可達(dá)數(shù)百kb；且轉(zhuǎn)基因不含任何病毒基因組片段，絕對(duì)安全。缺點(diǎn)：整合機(jī)制不明確，無(wú)規(guī)律隨機(jī)整合，多拷貝整合導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因不表達(dá)；整合位點(diǎn)隨機(jī)會(huì)造成轉(zhuǎn)移動(dòng)物基因組的重排、突變、易位缺失等；需顯微操作儀，技術(shù)性要求強(qiáng)。第44頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES）是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）分離出來(lái)的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細(xì)胞。它是一種含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞?？梢栽隗w外進(jìn)行人工培養(yǎng)，擴(kuò)增，并能以克隆的形式保存。9.2.3胚胎干細(xì)胞方法第45頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第46頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1.ES細(xì)胞的建立與維持動(dòng)物的準(zhǔn)備：取受精之后3.5天的母鼠分離鼠胚。胚胎的分離和初培養(yǎng)：3.5天孕鼠鼠斷頸處死解剖小鼠取出胚胎體外培養(yǎng)胚胎4—6天后，離散ICM。ICM的離散與ES的分離：分離ICM酶解細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)離散細(xì)胞ES細(xì)胞集落ES細(xì)胞的擴(kuò)增：離散ES細(xì)胞置四孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)ES細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)：ES細(xì)胞由四孔板轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)第47頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第48頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.ES細(xì)胞的基因組操作將外源基因移入到ES細(xì)胞基因組后，既能高效穩(wěn)定表達(dá)，又不影響ES細(xì)胞的各種功能。這就要求目的基因必須要定點(diǎn)參入，并且參入整合后，對(duì)原有基因結(jié)構(gòu)及功能沒有影響或影響最小。第49頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二與整合位點(diǎn)兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列（HB1和HB2）轉(zhuǎn)入的目的基因（TG）編碼抗G418的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor）兩個(gè)不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）第50頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞的篩選——正負(fù)選擇法

正選擇法篩選出轉(zhuǎn)基因整合型ES細(xì)胞：通過(guò)物理方法將重組DNA分子導(dǎo)入ES細(xì)胞，在含有抗菌素G418的培養(yǎng)基中，沒有整合外源基因的細(xì)胞將全部死亡，只有整合了外源基因的細(xì)胞才可以存活下來(lái)。負(fù)選擇法篩選出特異整合型ES細(xì)胞：如果非特異性整合發(fā)生，則兩個(gè)tk基因或其中一個(gè)基因很大可能與TG和neor一起整合，這時(shí)用GCV篩選，tk基因表達(dá)的胸苷激酶能反GCV(環(huán)鳥苷)轉(zhuǎn)化成毒性氨基酸，使細(xì)胞死亡。這是負(fù)選反擇。第51頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4.轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞的檢測(cè)第52頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二5.轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育正確整合的轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后就可以移入胚泡期的供體胚胎了。將這些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宮內(nèi)，繁育轉(zhuǎn)基因小鼠。第53頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二6.獲得純合的轉(zhuǎn)基因鼠第54頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點(diǎn)：基因轉(zhuǎn)移效率大大提高，且能進(jìn)行定位基因轉(zhuǎn)移。缺點(diǎn)：需要多代才能得到純合的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這對(duì)飼養(yǎng)成本高，產(chǎn)仔數(shù)較少的大型哺乳類動(dòng)物來(lái)說(shuō)，要獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是一件需要大量資金投入的事情。第55頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1.反轉(zhuǎn)錄病毒感染法的原理9.2.3反轉(zhuǎn)錄病毒法第56頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.反轉(zhuǎn)錄病毒感染法的載體的構(gòu)建提取病毒未整合的環(huán)狀形式DNA；將環(huán)狀DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；選擇適當(dāng)?shù)拿笇⒉《窘Y(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)切除；將外源目的基因克隆到載體中第57頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.通過(guò)物理方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞

反轉(zhuǎn)錄病毒載體的工作原理：寄生在受體細(xì)胞中的重組病毒由于沒有包裝信號(hào)，能生產(chǎn)病毒RNA和所有蛋白質(zhì)，但不能包裝成病毒顆粒；病毒載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后，載體上的包裝信號(hào)將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒。第58頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4.重組反轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎（1）人為感染著床前或著床后的胚胎。（2）直接將胚胎與能釋放反轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共孵育以達(dá)到感染目的?？赏ㄟ^(guò)病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中。

第59頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二優(yōu)點(diǎn)：能有效地將基因整合入受體細(xì)胞的基因組內(nèi)，單拷貝整合型；轉(zhuǎn)基因整合后能穩(wěn)定地遺傳；整合機(jī)制相應(yīng)明確，在TR區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，不會(huì)破壞轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)缺點(diǎn)：載量較小，一般只有8kb，可能會(huì)因缺少必須的調(diào)控元件而影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)；盡管病毒載體被設(shè)計(jì)為復(fù)制缺陷型的，但在包裝細(xì)胞的包裝過(guò)程中，若與整合型輔助表達(dá)基因組發(fā)生同源重組，就有可能組裝成野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，因此在構(gòu)建具有商業(yè)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，一般使用受到限制。操作繁瑣。第60頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二9.2.4精子載體法顯微注射技術(shù)的效率很低，設(shè)備昂貴。直接用精子作為外源DNA載體的轉(zhuǎn)移方法。主要問(wèn)題：重復(fù)性不好第61頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二基本原理和方法精子直接與外源DNA混合培養(yǎng)，外源基因可以直接進(jìn)入精子頭部，受精后就可發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。后來(lái)Rottman對(duì)此方法進(jìn)行了改進(jìn)，將外源DNA在與精子共孵育之前用脂質(zhì)體包埋，使脂質(zhì)體與DNA相互作用形成脂質(zhì)體——DNA復(fù)合物。這種復(fù)合體比較容易和精子細(xì)胞融合，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。第62頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二DNA的提取斑點(diǎn)雜交和PCR擴(kuò)增Southern雜交Northern雜交表達(dá)產(chǎn)的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)第63頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用研究基因的結(jié)構(gòu)與功能研究基因的組織特異性表達(dá)研究發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控克隆在發(fā)育中起重要作用的基因基因多級(jí)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究細(xì)胞功能研究9.3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用第64頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二基因打靶基因整合三種方式：基因隨機(jī)插入基因敲除基因替換基因打靶第65頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二基因敲除（geneknockout），是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。這與早期生理學(xué)研究中常用的切除部分——觀察整體——推測(cè)功能的三部曲思想相似。第66頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二基因敲除的技術(shù)路線如下：

（1）構(gòu)建重組基因載體﹔

（2）用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)﹔

（3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞﹔

（4）將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長(zhǎng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)。第67頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用研究病毒性疾病研究建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與基因治療生產(chǎn)天然活性藥物蛋白第68頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的低效性轉(zhuǎn)入基因造成宿主基因突變問(wèn)題轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)問(wèn)題病毒轉(zhuǎn)基因研究存在的問(wèn)題轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型與預(yù)期不符問(wèn)題乳腺生物反應(yīng)器的問(wèn)題社會(huì)問(wèn)題9.2.7轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究存在的問(wèn)題第69頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫動(dòng)物生物反應(yīng)器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過(guò)人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器,動(dòng)物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。9.4動(dòng)物生物反應(yīng)器第70頁(yè)，共78頁(yè)，2023年，2月20日，星期二微生物反應(yīng)器植物反應(yīng)器動(dòng)物反應(yīng)器

(一)優(yōu)點(diǎn)1可以利用發(fā)酵工程技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)。2胞外活性物質(zhì)制備容易。

（二）不足1哺乳動(dòng)物或人類的基因往往不能表達(dá)。有些表達(dá)了，卻沒有活性，需要進(jìn)一步修飾。2真核生物蛋白質(zhì)翻譯后加工的精確性有限。3需要大型發(fā)酵設(shè)備和車間。4細(xì)菌發(fā)酵常形成不溶聚合物，使下游加工成本增加。

（一）優(yōu)點(diǎn)1可大規(guī)模種植，上游生產(chǎn)成本較低。作為食物可省去下游加工步驟。2轉(zhuǎn)基因植物自交后可得到穩(wěn)定遺傳的遺傳性狀。3可利用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)大量制備。（二）不足1植物種植受季節(jié)、環(huán)境影響。2需專門的活性物質(zhì)分離設(shè)備與技術(shù)。3植物細(xì)胞培養(yǎng)需要發(fā)酵罐等設(shè)備和技術(shù)支持，成本較高。

（一）優(yōu)點(diǎn)1易養(yǎng)殖，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備。2通過(guò)乳腺和血液制備活性物質(zhì)簡(jiǎn)單易行。3可以通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)大量制備。

（二）不足1細(xì)胞培養(yǎng)需要昂貴的培養(yǎng)基和設(shè)備。2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備成本昂貴。3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物易產(chǎn)生一些倫理問(wèn)題。