質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測課件

質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測一.實驗?zāi)康?.通過質(zhì)粒DNA的提取和檢測，掌握提取質(zhì)粒的方法以及用凝膠電泳分離鑒定質(zhì)粒DNA的方法。二.實驗原理1.質(zhì)粒概述:

質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位，現(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。

目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細菌質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量一般較小，約為細菌染色體的0.5%-3%,大小在1Kb-200Kb之間。

在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)?？梢约喾N有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。2。質(zhì)粒DNA的提?。?/p>

已經(jīng)提出過許多方法用于從細菌中提純質(zhì)粒DNA，這些方法都含有以下3個步驟：

◆細菌培養(yǎng)物的生長。

◆細菌的收獲和裂解

◆質(zhì)粒DNA的純化。

三.儀器和試劑試劑:1、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖腥芤?（SET緩沖液）、溶液2（LysisBuffer)、溶液3（3MNaAc,Ph4.8)、結(jié)合緩沖液、漂洗液、洗脫緩沖液、吸附柱、廢液收集管2、電泳檢測TAE緩沖液、瓊脂糖、Loadingbuffer、EB儀器、耗材：臺式高速離心機、電泳儀、電泳槽、移液器、1.5mlEppendorf管四.操作步驟(1)培養(yǎng)細菌:大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基2ml-5ml中,37度振蕩培養(yǎng)8-16小時.(2)收集菌體：取培養(yǎng)液1.5ml于Eppendorf管中,12000rpm離心3分鐘,去掉上清液.(3)裂解：加入100ul溶液1（用完后4度保存）,充分吹打混勻后,加入150ul溶液2（用完立即擰緊瓶蓋）,溫和顛倒5-10次,零下20度放置3分鐘.加入150ul溶液3,溫和顛倒5-10次,放置5分鐘.12000rpm離心5分鐘(4)收集質(zhì)粒：取吸附柱，加入420ul結(jié)合緩沖液，取離心后的上清液到吸附柱中（不要吸到蛋白沉淀），混勻.12000rpm離心30秒,棄去廢液.吸附柱裝回收集管。(5)向吸附柱加入700ul漂洗液，12000rpm離心30秒。倒掉廢液，裝回吸附柱。(6)重復(fù)（5），再次12000rpm離心2分鐘以完全去除漂洗液。(7)回收質(zhì)粒：將吸附柱移到一個新的1.5mleppendorf管中，向吸附膜中央加入50ul洗脫緩沖液（水浴預(yù)熱至70度），溶解提取物,室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘.(8)瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結(jié)果