生物碩士畢業(yè)答辯

生物碩士畢業(yè)答辯第1頁(yè)/共24頁(yè)主要內(nèi)容研究背景目的及意義實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線方法與結(jié)果創(chuàng)新與結(jié)論第2頁(yè)/共24頁(yè)研究背景脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的唯一與肥胖呈負(fù)相關(guān)性的特異性血漿蛋白。肥胖、冠心病、Ⅱ型糖尿病患者血漿中的脂聯(lián)素低于正常水平。編碼人脂聯(lián)素的apMI基因定位于染色體3q27上，長(zhǎng)度為16kbp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。人脂聯(lián)素由244個(gè)氨基酸組成，由分泌信號(hào)序列、特異序列、膠原重復(fù)序列、球狀序列等4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中球狀區(qū)(gADPN)是脂聯(lián)素生物活性的關(guān)鍵部位。脂聯(lián)素(adiponectin)第3頁(yè)/共24頁(yè)目的及意義可作為冠心病、糖尿病的輔助診斷依據(jù)，并對(duì)疾病發(fā)生進(jìn)行有效的預(yù)警；可作為評(píng)價(jià)藥物在治療肥胖、冠心病和糖尿病疾病方面的效果；進(jìn)一步研究脂聯(lián)素作用機(jī)制提供方便；利用基因工程方法制備脂聯(lián)素定量檢測(cè)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品，提高了穩(wěn)定性和生物安全性。本研究建立的血漿脂聯(lián)素酶免定量檢測(cè)方法——第4頁(yè)/共24頁(yè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線第5頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（一）人脂聯(lián)素基因去信號(hào)肽區(qū)的克隆與鑒定第6頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（一）總RNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×40μg/mlOD280=0.254，OD260=0.485RNA含量=0.485×1×40=19.4μg/mL純度=OD260/OD280=0.485/0.254=1.910人脂肪組織總RNA的提取第7頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（一）2、PCR擴(kuò)增目的基因(678bp)

M.DNAMarkerDL2000；

1.PCRproduct;2.Negativecontrol3、重組質(zhì)粒酶切鑒定M.DNAmarkerDL2000;1.BamHⅠ+XhoⅠdigestionproducts

bpM1220001000750500250100bpM120001000750500250100第8頁(yè)/共24頁(yè)重組ΔSADPN蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化方法與結(jié)果（二）第9頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（二）1、重組菌BL21(DE3)/pET41a/ΔSADPN誘導(dǎo)表達(dá)(54.5kD)M..ProteinmoleculeweightMarker;1.Normalcelllysatescontrol;2.celllysatesinducedat25℃for6hours;3.Supernatantofcelllysatesinducedat25℃for6hours;4.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃for6hours;KD

M123497.266.444.329.020.1第10頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（二）2、重組ΔSADPN蛋白活性鑒定3、重組ΔSADPN蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

M.ProteinmoleculeweightMarker;1～3.Supernatantofcelllysatesinducedat25℃30℃37℃4～6.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃30℃37℃KDM12345697.266.444.329.020.1第11頁(yè)/共24頁(yè)誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化1～4.Supernatantofcellllysatesinducedat25℃for(4/6/8/10)hours5～8.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃for(4/6/8/10)hours方法與結(jié)果（二）12345678第12頁(yè)/共24頁(yè)誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化1～4.Supernatantofcelllysatesinducedat25℃for(0.10/0.05/0.03/0.02)mol/LIPTG5～8.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃for(0.10/0.05/0.03/0.02)mmol/LIPTG方法與結(jié)果（二）12345678第13頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（二）M..ProteinmoleculeweightMarker;1.Sampleofimpurification;2.Elutionproductswith20mmol/LImidazole;3.Elutionproductswith50mmol/LImidazole;4.Elutionproductswith100mmol/LImidazole;5.Elutionproductswith200mmol/LImidazole.4、重組ΔSADPN蛋白的純化KDM1234597.266.444.329.020.1第14頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（三）雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的初步建立第15頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（三）1、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的制備2、標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性試驗(yàn)

t=1.112，顯著性概率（Sig.）P=0.309＞0.05，表明在2～8℃和37℃放置144h檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有顯著性差異，制備的標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性較好。第16頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（三）3、包被抗體和檢測(cè)抗體最佳濃度的選擇第17頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（三）4、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制第18頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（三）5、精密性試驗(yàn)6、方法對(duì)比試驗(yàn)第19頁(yè)/共24頁(yè)方法與結(jié)果（三）t=0.-0.631，P=0.530＞0.05，兩者檢測(cè)結(jié)果之間沒(méi)有顯著性差異

第20頁(yè)/共24頁(yè)創(chuàng)新與結(jié)論成功構(gòu)建了含有脂聯(lián)素去信號(hào)肽區(qū)域的重組質(zhì)粒pET-41a/ΔSADPN，實(shí)現(xiàn)了脂聯(lián)素的可溶性表達(dá)；制備脂聯(lián)素定量檢測(cè)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品，建立了人脂聯(lián)素ELISA定量檢測(cè)方法；本實(shí)驗(yàn)所建立的人脂聯(lián)素ELISA定量檢測(cè)方法與國(guó)內(nèi)上市同類產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性，可用于臨床檢測(cè)。第21頁(yè)/共24頁(yè)致謝本論文是在王云龍老師的悉心指導(dǎo)和親切關(guān)懷下完成的，在此謹(jǐn)向?qū)煴硎旧钌畹闹x意和崇高的敬意！向培養(yǎng)我的母校和傳授我知識(shí)的全體老師致以崇高的敬意，向研究生處的領(lǐng)導(dǎo)和老師們表示衷心的感謝！特