七流式細胞儀課件

第六章流式細胞技術(shù)的原理與應(yīng)用FlowCytometry一、流式細胞儀概述流式細胞儀（FlowCytometry,FCM）是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)及細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。所謂流式細胞術(shù)，就是利用流式細胞儀對細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)。

研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球；研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量。流式細胞儀分為三大類：

臺式機，臨床型，特點：儀器的光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動化程度高，操作簡便，易學(xué)掌握。

大型機，科研型，特點：分辨率高，可快速將所感興趣的細胞分選出來，并可以將單個細胞或指定個數(shù)的細胞分選到特定的培養(yǎng)孔或培養(yǎng)板上，同時可選配多種波長類型的激光器，適用于更廣泛靈活的科學(xué)研究。

新型流式細胞儀，特點：隨著激光技術(shù)的不斷發(fā)展，儀器選用2-4根激光管，最多檢測13個熒光參數(shù)，加上散射光信號可達到15個參數(shù)同時分析。還可以實驗現(xiàn)高速分先，速度達到50000個/s，并可進行遙控分選，能夠滿足多種科學(xué)研究的要求。三、流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)，其理想狀態(tài)是把細胞傳送到激光束的中心。而且在特定時間內(nèi)，應(yīng)該只有一個細胞或粒子通過激光束。光學(xué)系統(tǒng)由光學(xué)激發(fā)器和光學(xué)收集器組成。光學(xué)激發(fā)器包括激光和透鏡，透鏡用于形成激光束，并使之聚焦。光學(xué)收集器則由若干透鏡組成，用于收集粒子發(fā)射的光束---激光束相互作用，透鏡組和濾片發(fā)送激光束至相應(yīng)的光學(xué)探測器。光平臺的設(shè)計可實現(xiàn)以上功能。光學(xué)系統(tǒng)Fluorochromespecification電子系統(tǒng)負責(zé)光電轉(zhuǎn)換和數(shù)據(jù)處理1散射光信號激發(fā)光光散射分析：從非均一的細胞群體中鑒別出某些亞群側(cè)向角散射光（SSC）SideScatter：細胞粒度及細胞內(nèi)相對復(fù)雜性前向角散射光（FSC）ForwardScatter：細胞相對大小及其表面積外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖

（紅細胞溶解后）白細胞淋巴細胞單核細胞

粒細胞

根據(jù)散射光信號從人白細胞中鑒別出不同亞群：流式細胞儀的信號分析熒光信號的分析流式細胞儀的信號分析數(shù)據(jù)存儲:LISTMODE數(shù)據(jù)顯示:

直方圖(Histogram)二維點圖(DotPlot)等高線圖(ContourPlot)密度圖(Density)三維圖（3DPlot）等流式細胞儀的數(shù)據(jù)分析點圖分析流式細胞儀的數(shù)據(jù)分析流式細胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大??；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理，將分析結(jié)果顯示在計算機屏幕上，液可以打印出來，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達，其X軸為測量強度，Y軸為細胞數(shù)目。一般來說，流式細胞儀坐標軸的分辨率有512或1024通道數(shù)，這視其模數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)，既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現(xiàn)細胞的分離。BD--流式技術(shù)的先鋒全球第一臺流式細胞儀FACSI（1973）全球第一臺全自動4色流式細胞儀FACSCalibur全球第一臺免校準,雙激光6色流式細胞儀BDLSR

落地式流式細胞分選儀FACSVantageSE全球第一臺高速流式細胞分選儀FACSAria經(jīng)濟普及型流式細胞儀

FACSCount

MarketshareofBDFCM：worldwide75%，China70%流式細胞儀一覽流式細胞儀一覽BDFACSAriaBDFACSCaliburBDFACSVantageSE

BDLSRBD流式機型特點/優(yōu)勢FACSAria固定光路校準技術(shù)，無需每日調(diào)整光路三根激光：488nm/633nm/407nm

一次同時分選2/4群不同特性細胞單激光——7色熒光＋1散射光信號三激光——13色熒光＋2散射光信號FACSCalibur世界上分析速度最快的臺式機（104細胞/秒）獨特的分送和濃縮系統(tǒng)，大大提高細胞回收率雙激光：488nm/635nm

四色熒光＋2散射光信號BDLSR可三根激光：488nm/325nm/(633)nm

固定校準，6色熒光＋2散射光信號分擔(dān)落地型FCM分析工作，使之專門用于分選細胞FACSVantageSE雙激光：488nm/UV6色熒光＋2散射光信號高速分選：2.5萬細胞/秒NewCommon流式細胞儀一覽流式細胞儀的檢測范圍細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期蛋白質(zhì)含量RNA含量細胞功能細胞表面/胞漿/核內(nèi)特異性抗原細胞活性和酶活性細胞因子和受體激素結(jié)合位點胞內(nèi)鈣離