章吸光光度法課件

第8章吸光光度法8.1概述8.2光吸收的基本定律8.3光度計的基本部件8.4顯色反應(yīng)與分析條件的選擇8.5吸光度測量條件的選擇8.6吸光光度法的應(yīng)用2023/4/18化學(xué)分析：常量組分(>1%),Er:0.1%～0.2%

依據(jù)化學(xué)反應(yīng),使用玻璃儀器

化學(xué)分析與儀器分析方法比較儀器分析：微量組分(<1%),Er:1%～5%

依據(jù)物理或物理化學(xué)性質(zhì),需要特殊的儀器例:

含F(xiàn)e約0.05%的樣品,稱0.2g,則m(Fe)≈0.1mg容量法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,測不準(zhǔn)光度法結(jié)果0.048%～0.052%,滿足要求準(zhǔn)確度高靈敏度高2023/4/182.電化學(xué)分析法:

依據(jù)物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及其變化3.色譜法:

氣相色譜,液相色譜4.質(zhì)譜法、熱分析法、放射化學(xué)法等非光譜法（折射法，濁度法，旋光法）（不以光的波長為特征訊號）光譜法分子光譜法

UV/Vis,IR原子光譜法

AAS,AES（以光的吸收、發(fā)射等作用而建立的分析方法，通過檢測光譜的波長和強度來進行定性和定量的方法）光學(xué)分析法1.光學(xué)分析法:基于電磁輻射與物質(zhì)的相互作用.2023/4/188.1

概述

一.特點

靈敏度高：測定下限可達10-5～10-6mol·L-1,(10-8mol·L-1)準(zhǔn)確度高:能夠滿足微量組分的測定要求：相對誤差2～5％（1～2％）操作簡便快速應(yīng)用廣泛2023/4/18

包括：比色法、可見分光光度法、紫外分光光度法、紅外光譜法等。

2023/4/18結(jié)論:一定波長的光具有一定的能量，波長越長(頻率越低)，光量子的能量越低.二、光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，它具有波粒二象性，光具有一定的能量。E=hν=hc/λ2023/4/181

吸收光譜產(chǎn)生的原因光:一種電磁波,波粒二象性

光譜名稱波長范圍X射線0.1~10nm遠(yuǎn)紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可見光400~750nm近紅外光0.75~2.5um中紅外光2.5~5.0um遠(yuǎn)紅外光5.0~1000um微波0.1~100cm無線電波1～1000m當(dāng)光子的能量與分子的E匹配時，就會吸收光子

E=hu=hc/l2023/4/18三、物質(zhì)對光的選擇性吸收單色光：具有相同能量(相同波長)的光.復(fù)合光：具有不同能量(不同波長)的光復(fù)合在一起.例如白光.互補光：把兩種適當(dāng)顏色的光按一定的強度比例混合，成為白光，稱為互補色光。

2023/4/18/nm顏色互補光400-450紫黃綠450-480藍黃480-490綠藍橙490-500藍綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍610-650橙綠藍650-780紅藍綠不同顏色的可見光波長及其互補光2023/4/18吸收曲線：測量某種物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度，以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到的一條吸收光譜曲線。用途：①進行定性分析；②進行定量分析；③選擇吸收波長；④判斷干擾情況。2023/4/18吸收曲線的討論：（1）不同物質(zhì),曲線形狀不同，最大吸收波長λmax不同，可用作定性鑒定各種物質(zhì)（2）同一種物質(zhì)，濃度不同，其吸收曲線形狀相似，λmax不變。2023/4/18（3）同一種物質(zhì)，濃度不同，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。（4）吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。2023/4/188-2光的吸收定律

──朗伯-比耳（Larnbert-Beer）定律吸光度與物質(zhì)濃度

A∝c吸光度與液層厚度

A∝b①②2023/4/18朗伯定律:(1760)

A=lg(I0/It)=k1b

當(dāng)入射光的

,吸光物質(zhì)的c一定時,溶液的吸光度A與液層厚度b成正比.比爾定律(1852)

A=lg(I0/It)=k2c

當(dāng)入射光的,液層厚度b

一定時,溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)的c成正比.2023/4/18一.朗伯-比爾定律意義:

當(dāng)一束平行單色光通過均勻、透明的吸光介質(zhì)時，其吸光度與吸光質(zhì)點的濃度和吸收層厚度的乘積成正比.A=lg(I0/It)=kbc2023/4/18吸光度A、透射比T與濃度c的關(guān)系A(chǔ)T(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

202023/4/18K的表示方法a

的單位:L·g-1·cm-1當(dāng)c的單位用g·L-1表示時，用a表示，a

－吸光系數(shù)Absorptivity

A＝abcε

的單位:L·mol-1·cm-1當(dāng)c的單位用mol·L-1表示時，用ε表示.

－摩爾吸光系數(shù)MolarAbsorptivity

A＝ε

bc

ε

=Ma

2023/4/18摩爾吸光系數(shù)e靈敏度表示方法A=e

bcA=Kbcc:mol/Le

表示物質(zhì)的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時溶液的吸光度。單位：

(L?mol-1?cm-1)c:g/LA=abca:吸光系數(shù)2023/4/18朗伯-比爾定律的適用條件1.單色光

應(yīng)選用max處或肩峰處測定.3.稀溶液

濃度增大，分子之間作用增強.2.吸光質(zhì)點形式不變

離解、配合、締合會破壞線性關(guān)系,

應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等).2023/4/18溶液濃度的測定A＝bc工作曲線法(校準(zhǔn)曲線)朗伯-比爾定律的分析應(yīng)用

01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx2023/4/18吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A

=e1bc1+e2bc2

根據(jù)吸光度的加和性可以進行多組分的測定以及某些化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)的測定在某一波長，溶液中含有對該波長的光產(chǎn)生吸收的多種物質(zhì)，那么溶液的總吸光度等于溶液中各個吸光物質(zhì)的吸光度之和

A=A1+A2+…+An2023/4/18二.偏離比爾定律的原因2023/4/181.非單色光引起的對吸光定律的偏離λ1λ22023/4/18實際上入射光為：λ1+λ2當(dāng)κ1=

κ2時，A總

=

κ1bc，遵守比耳定律當(dāng)κ1≠

κ2時，A總

≠

κ1bc，偏離比耳定律2023/4/18吸光質(zhì)點間相互作用引起的對吸光定律的偏離質(zhì)點間的靜電作用質(zhì)點的散射質(zhì)點間的化學(xué)反應(yīng)2023/4/18

溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡破壞了平衡濃度分析濃度的正比關(guān)系，造成對朗伯—比耳定律的偏離。

2.散射

試樣不均勻,被測液含懸浮物或膠粒等散射指點時,入射光因散射而損失。3.化學(xué)因素例：Cr2O72-+

H2O=

CrO42-+

2H+橙色（λmax=350nm）黃色（λmax=375nm）2023/4/18

朗伯—比耳定律是建立在所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用的前提下的，當(dāng)溶液濃度較高（c>10-2

mol·L-1）時，吸光質(zhì)點間分子或離子的平均距離減小，就會發(fā)生相互作用而改變吸光質(zhì)點的電荷分布，改變它們對光的吸收能力，即改變吸光質(zhì)點的摩爾吸光系數(shù)，濃度越大，這種影響就越顯著。朗伯—比耳定律只適用于稀溶液(c<10-2mol·L-1)。

4.溶液濃度2023/4/188.2光度計及基本部件方便、靈敏，準(zhǔn)確度差.常用于限界分析.1.目視比色法觀察方向空白c1c2c3c42023/4/18目視比色法標(biāo)準(zhǔn)系列未知樣品特點利用自然光比較吸收光的互補色光準(zhǔn)確度低（半定量）不可分辨多組分方法簡便，靈敏度高2023/4/182.光電比色法光電比色計結(jié)構(gòu)示意圖通過濾光片得一窄范圍的光(幾十nm)濾光片的顏色與有色溶液的顏色互補.2023/4/183.吸光光度法和分光光度計光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)分光光度計的基本組成通過棱鏡或光柵得到一束近似的單色光.波長可調(diào),故選擇性好,準(zhǔn)確度高.2023/4/18常用光源光源波長范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見，近紅外氙燈180~1000紫外、可見（熒光）能斯特?zé)?000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學(xué)手段2023/4/18單色器作用:產(chǎn)生單色光常用的單色器：棱鏡和光柵樣品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材質(zhì)：玻璃比色皿－－可見光區(qū)石英比色皿－－可見、紫外光區(qū)2023/4/18吸收池(比色皿)：用于盛待測及參比溶液。

可見光區(qū)：光學(xué)玻璃池 紫外區(qū)：石英池檢流計（指示器）：

低檔儀器：刻度顯示中高檔儀器：數(shù)字顯示，自動掃描記錄檢測器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成電流訊號。

光電池，光電管，光電倍增管2023/4/18檢測器

作用：接收透射光，并將光信號轉(zhuǎn)化為電信號常用檢測器：光電管光電倍增管光二極管陣列光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用625－1000nm波長；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200－625nm波長2023/4/18單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的 裝置。

棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同.玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ28006005004002023/4/18光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。

利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光。波長范圍寬,色散均勻,分辨性能好,使用方便.－平面透射光柵－反射光柵（廣泛使用）光柵衍射示意圖M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵2023/4/18硒光電池（Barrier-layerphotocell）適用于300-800nm,在500-600nm范圍最靈敏。Se陰極Au，Ag半導(dǎo)體h陽極2023/4/18光電管(Phototube)h（片）紅敏管625-1000nm藍敏管200-625nm2023/4/18光電倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)1個光子可產(chǎn)生106～107個電子160-700nm2023/4/18目視比色法—比色管光電比色法—光電比色計

光源、濾光片、比色池、硒光電池、檢流計分光光度法與分光光度計

722型分光光度計光學(xué)系統(tǒng)圖1.光源；2.濾光片；3,8聚光鏡4,7.狹縫；5.準(zhǔn)直鏡；6.光柵9.比色池；10.光電管2023/4/183、光度計組成：2023/4/182023/4/18練習(xí)題1、人眼能感覺到的光稱為可見光，其波長范圍是A.400-780nmB.200-320nmC.200-780nmD.200-1000nm答案：A2、符合比爾定律的一有色溶液，當(dāng)其濃度增大時，最大吸收波長和吸光度分別是A.不變，增加B.不變，減少C.增加，不變D.減少，不變答案：A

2023/4/183、下列表述不正確的是A.吸收光譜曲線，表明了吸光度隨波長的變化關(guān)系B.吸收光譜曲線中,最大吸收處的波長為最大吸收波長C.吸收光譜曲線，以波長為縱坐標(biāo),以吸光度為橫坐標(biāo)D.吸收光譜曲線，表明了吸光物質(zhì)的吸收特性答案：C4、影響有色物質(zhì)摩爾吸收系數(shù)的因素是A.吸收池厚度B.入射光波長C.有色物質(zhì)溶液的濃度D.入射光的強度答案：B2023/4/185、某有色物質(zhì)溶液，遵守比爾定律，當(dāng)其濃度為c時，用1.00cm比色皿測得其透光度為T，，當(dāng)濃度減小為0.50c時，，在同樣條件下測定，其透光率應(yīng)為

A.T2B.2TC.T1/2D.T/2答案：c

lg1/T=εbc

6、某有色物質(zhì)溶液，遵守比爾定律，當(dāng)其濃度為c時，吸光度A=0.30，那么當(dāng)濃度為2c時，該溶液的吸光度A

=。0.602023/4/188-4

顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇一.顯色劑與顯色反應(yīng)無機顯色劑:SCN-

[Fe(SCN)]2+

H2O2

[TiO·H2O2]2+硫氰酸鹽：測定Fe3+、Mo(Ⅵ)、W(Ⅴ)鉬酸銨：測定P、Si、W等。過氧化氫：測定V5+、Ti4+等2023/4/18：：：：助色團－NH2，－OH，－X（孤對電子）O生色團：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共軛雙鍵）有機顯色劑:①偶氮類：偶氮胂Ⅲ，偶氮氯膦，PAR等；②三苯甲烷類：鉻天青S，二甲酚橙，結(jié)晶③其它型：OO,NN,含S型等。2023/4/18有機顯色劑CH3－C－C－CH3HO－NN－OH

＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：雙硫腙NN型：丁二酮肟鄰二氮菲磺基水楊酸2023/4/18二.顯色反應(yīng)的選擇

靈敏度高，一般ε

>104;選擇性好;對比度大,△max=MRmax

-Rmax>60nm;反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定，穩(wěn)定;顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好.2023/4/18三.顯色條件的確定c(R)c(R)c(R)1.顯色劑用量（c(M)、pH一定）Mo(SCN)32+

淺紅Mo(SCN)5

橙紅Mo(SCN)6-淺紅Fe(SCN)n3-n2023/4/182.顯色反應(yīng)酸度（c(M)、c(R)一定）pH1<pH<pH2pH2023/4/1825℃50℃t/minA3.顯色溫度及顯色時間

(c(M)、c(R)、pH一定)另外，還有介質(zhì)條件、有機溶劑、表面活性劑等.2023/4/184.顯色溫度的選擇：一般在室溫，有時需加熱，通過實驗確定2023/4/185.干擾及其消除：（1）控制溶液酸度；（2）加入絡(luò)合掩蔽劑或氧化還原掩蔽劑；（3）選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL，要求吸收大，干擾??；（4）選擇合適的參比溶液；（5）采用適當(dāng)?shù)念A(yù)先分離的方法。2023/4/18Fe3+,Cu2+FeSSal（紫紅）Cu2+pH=2.5SSal測Fe3＋:(控制pH)如不能通過控制酸度和掩蔽的辦法消除干擾，則需采取分離法。（1）控制溶液酸度；2023/4/18（2）加入配位掩蔽劑Co2+,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(藍)⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－測Co2＋

:2023/4/18（3）選擇適當(dāng)?shù)臏y定波長515655415500釷-偶氮砷III

鈷-亞硝基紅鹽

AA絡(luò)合物絡(luò)合物試劑試劑/nm/nm2023/4/18四、多元配合物多元配合物是由三種或三種以上的組分所形成的配合物。目前應(yīng)用較多的是由一種金屬離子與兩種配位體所組成的三元配合物，三元配合物在吸光光度分析中應(yīng)用較普遍。主要特點為；1、穩(wěn)定性強；2、對比度和靈敏度高；3、選擇性好。2023/4/189-5吸光度測量條件的選擇一、入射光波長的選擇1、原則：“吸收最大，干擾最小”，2023/4/18二、參比溶液的選擇1、蒸餾水：試液、顯色劑均無色時，用蒸餾水作參比；2、試劑空白：顯色劑有色時，用不加試樣溶液的試劑空白作參比；3、試液空白：試液中有其它有色離子時，用不加顯色劑的被測液作參比；4、褪色空白：顯色劑和試液均有色時，加一掩蔽劑掩蔽被測組分，以此溶液作參比；2023/4/18三、吸光度讀數(shù)范圍的選擇A=-lgT=εbc,(1)-d（lgT）=-0.434d（lnT）=εbdc=-0.434dT/T=εbdc(2)=同除εbc,以有限值表示：=ΔT：±0.2%~±2%。假定為0.5%，2023/4/182023/4/181086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434濃度測量的相對誤差與T(或A)的關(guān)系實際工作中，應(yīng)控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之間(調(diào)c,b,)2023/4/18四、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1、制作依據(jù)：比爾定律A=εbcA∝c

2、制作方法：在選擇的實驗條件下，從低濃度到高濃度分別測量一系列（不少于5）不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測組分的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到一條通過原點的直線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線（或工作曲線）。此時再測量待測溶液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以查到與之相對應(yīng)的被測物質(zhì)的含量。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點原因：參比選擇不當(dāng)；吸收池厚度不等；吸收池位置不妥；吸收池不清潔等。2023/4/18練習(xí)題1、以M表示被測物質(zhì)的摩爾質(zhì)量，則摩爾吸收系數(shù)ε與吸光系數(shù)a之間的關(guān)系為A.ε=a/MB.ε=aMC.ε=aM/1000D.ε=(a/M)×1000答案：

B2、在光度分析中，選擇參比溶液的原則是A.一般選蒸餾水B.一般選試劑溶液C.根據(jù)加入試劑和被測試液的顏色性質(zhì)選擇D.一般選褪色溶液答案：C2023/4/183.下列幾組吸光度范圍，測量相對誤差較小的A.0.2~0.8B.0.1~0.8C.0.3~0.6D.0.2~0.6答案：C4、下列表述中錯誤的是A.吸收峰隨濃度增加而增高，但最大吸收波長不變B.透射光與吸收光互為補色光，黃色和蘭色互補C.比色法又稱分光光度法D.在公式A=εbc中，ε稱摩爾吸收系數(shù)，其數(shù)值越大，反應(yīng)越靈敏答案：C2023/4/185、某有色物質(zhì)溶液的吸光度值較小時，則表明A.該物質(zhì)的濃度較小B.該物質(zhì)摩爾吸收系數(shù)較小C.所用比色皿較薄D.上述三者都可能答案：D6、一有色溶液在一定波長下，測定其吸光度為0.740，如果溶液及比色皿都減小一半，則其吸光度為A.2.96

B.0.740

C.0.370D.0.185答案：D2023/4/187、為使某待測物質(zhì)測定的靈敏度較高，則應(yīng)選擇A.較高濃度的待測溶液B.采用具有較大吸收系數(shù)的體系C.在較長的波長下進行D.用較強的光源答案：B2023/4/188.5吸光光度法的應(yīng)用一.單一組分的測定1.金屬離子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-鈷試劑2.磷的測定:DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%,

可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷鉬黃(小)磷鉬(V)藍(大)Sn2+2023/4/18二.多組分的測定εxl1,εyl1,εxl2,εyl2由x,y標(biāo)液在1,2處分別測得.(1)在1處測組分x,在2處測組分y.(2)在1處測組分x;在2處測總吸收,扣除x吸收,可求y.(3)x,y組分不能直接測定A1=εxl1bcx+εyl1bcy(在1處測得A1)

A2=εxl2bcx+εyl2bcy(在2處測得A2)2023/4/18

三.光度滴定NaOH滴定對硝基酚pKa=7.15

間硝基酚pKa=8.39pKa=1.24V1V2V(NaOH)/mL對硝基酚間硝基酚酸形均無色.堿形均黃色2023/4/18典型的光度滴定曲線依據(jù)滴定過程中溶