蛋白質(zhì)電泳與操作課件

蛋白質(zhì)電泳與操作2012.4.13Questions：什么是氨基酸？氨基酸有何結(jié)構(gòu)特點(diǎn)？什么是肽？肽是如何形成的？形成肽的化學(xué)鍵是什么？什么是蛋白質(zhì)？蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是什么？蛋白質(zhì)特性氨基酸（aminoacid）含有一個(gè)堿性氨基和一個(gè)酸性羧基的有機(jī)化合物。是蛋白質(zhì)的基本組成單位。

氨基酸的酸堿性質(zhì)氨基酸在水溶液或結(jié)晶內(nèi)基本上均以兼性離子或偶極離子的形式存在。兼性離子：又稱為兩性離子是指在同一個(gè)氨基酸分子上帶有能釋放出質(zhì)子的NH3+正離子和能接受質(zhì)子的COO-負(fù)離子，因此氨基酸是兩性電解質(zhì)。氨基酸的等電點(diǎn)：氨基酸的帶電狀況取決于所處環(huán)境的PH值，改變PH值可以使氨基酸帶正電荷或負(fù)電荷，也可使它處于正負(fù)電荷數(shù)相等，即凈電荷為零的兩性離子狀態(tài)。使氨基酸所帶正負(fù)電荷數(shù)相等即凈電荷為零時(shí)的溶液pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)（isoelectricpoint）。蛋白質(zhì)特性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)（primarystructure）氨基酸之間以肽鍵形成的肽鏈中氨基酸的排列順序。二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondarystructure）蛋白質(zhì)分子中多肽鏈沿一定方向盤繞和折疊的方式。

三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上借助各種次級(jí)鍵卷曲折疊成特定的球狀分子結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象。

四級(jí)結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）多亞基蛋白質(zhì)分子中各個(gè)具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈，以適當(dāng)?shù)姆绞骄酆纤纬傻牡鞍踪|(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

關(guān)于電泳電泳（Electrophoresis）：是指帶電荷的粒子或分子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù)：利用帶電粒子或者分子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到對(duì)粒子或分子進(jìn)行分離的技術(shù)。電泳的相關(guān)參數(shù)電荷：粒子或分子的電荷性質(zhì)決定其在電場(chǎng)中的遷移方向。分子大小：分子大小決定了在特定電場(chǎng)強(qiáng)度下一定時(shí)間內(nèi)分子在介質(zhì)中的遷移距離。電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度決定了帶電粒子或分子在電場(chǎng)中的遷移速度。介質(zhì)密度：介質(zhì)密度決定了特定分子在其中的遷移距離，因此決定其對(duì)不同分子的分辨能力。蛋白質(zhì)變性電泳蛋白質(zhì)變性：蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)合力主要是半胱氨酸之間形成的二硫鍵（Disulfidebond）。而蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)變性就是使二硫鍵打開(kāi)，從而使蛋白質(zhì)亞基解離和三級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，使蛋白質(zhì)失去生物活性，故稱變性（denature）。蛋白質(zhì)變性的方法：95℃加熱5分鐘足以破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵，但是當(dāng)溫度降至常溫后，二硫鍵能夠重新形成，這個(gè)過(guò)程稱為復(fù)性（renature）。為了使變性后的蛋白不再?gòu)?fù)性通常使用β-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol）或二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）保護(hù)自由的半胱氨酸巰基。另外，為了避免復(fù)性，通常在加熱后立即放入冰浴以減少蛋白質(zhì)復(fù)性的機(jī)會(huì)。蛋白質(zhì)變性電泳的方法：十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）

SDS原理：

蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移率主要取決于分子大小、形狀以及所帶電荷多少。SDS是一種陰離子表面活性劑，在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上（達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可結(jié)合1.4gSDS），使各種蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。此時(shí)，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其它因素對(duì)電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合公式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。SDS操作程序蛋白質(zhì)樣品制備凝膠制備樣品上樣電泳凝膠染色電泳結(jié)果分析細(xì)胞裂解：按照每106細(xì)胞加75～100μl細(xì)胞裂解液（RIPA，含蛋白酶抑制劑），強(qiáng)烈震蕩30s后置冰浴30min，期間每5分鐘震蕩10s。臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)12000rpm，4℃離心5min。將上清移入另一干凈Eppendorf管，樣品可立即保存于-20℃

。如有必要，取5μl上清，ddH2O稀釋4X后用Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)變性根據(jù)需要取一定量裂解細(xì)胞樣品，加4X蛋白質(zhì)電泳上樣液（含5%巰基乙醇）使終濃度為1X，混勻。95℃加熱5min，立即置冰上，等待電泳。試劑：

ddH2O

30%Acr-Bis(29:1)10XTris/Glycine/SDSbuffer,pH8.810XTris/Glycine/SDSbuffer,pH6.810%過(guò)硫酸銨（Ammoniumpersulfate

，AP）

TEMED（Tetramethylethylenediamine，四甲基乙二胺）

*TEMED可以催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基，從而加速丙烯酰胺凝膠的聚合。裝置：

凝膠制備凝膠分離范圍：

SDS分離膠濃度最佳分離范圍6%膠50-150kD8%膠30-90kD10%膠20-80kD12%膠12-60kD15%膠10-40kDSDS凝膠的工作原理在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.8，分離膠pH8.8；而電泳緩沖液使用Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。凝膠配制的計(jì)算試劑名稱配制10ml不同濃度分離膠試劑用量/ml配制5ml濃縮膠試劑用量5%7.5%10%15%3%分離膠貯液（30%Acr-0.8%Bis)1.652.503.335.00-4X分離膠緩沖液（pH8.8Tris-HCl）2.502.502.502.50-濃縮膠貯液（10%Acr-0.5%Bis）----1.54X濃縮膠緩沖液（pH6.8Tris-HCl）----1.2510%SDS0.100.100.100.100.51%TEMED1.001.001.001.001.00ddH2O4.753.903.071.44.60混勻后，置真空干燥器中，抽氣10min10%AP0.050.050.050.050.025凝膠配制步驟安裝灌膠模具：注意壓緊，避免漏膠。配制分離膠溶液：配膠時(shí)分離膠的五個(gè)組分按表依次加入潔凈的配制分離膠的小燒杯內(nèi)，以攪拌混勻約10-20sec，均勻加入膠槽。灌制分離膠：灌膠后再在膠面上小心地鋪上一幾毫米厚的電泳緩沖液（pH8.8）（這可使凝固后的膠面平滑整齊），然后于37℃凝固15-30min。配制濃縮膠溶液：配膠時(shí)濃縮膠的五個(gè)組分按表依次加入潔凈的配制分離膠的小燒杯內(nèi)，以攪拌混勻約10-20sec，均勻加入膠槽，插入加樣梳。灌制濃縮膠：濃縮膠是用于濃縮蛋白質(zhì)樣品，位于整塊SDS膠的上層。常用濃度是5%，pH6.8。并用加樣梳形成加樣孔?？紫铝?.8～1.0cm的濃縮膠，以便蛋白質(zhì)樣品在這段膠的電泳中被濃縮并聚焦成窄線，有利于下面的分離膠分離不同分子量蛋白時(shí)形成清晰的條帶。SDS電泳凝膠染色銀染(silverstaining)考馬斯亮藍(lán)染色（CoomassieBrilliantBluestaining）CoomassieBrilliantBlueR-250CoomassieBrilliantBlueG-250

凝膠結(jié)果分析染色后的凝膠可以用凝膠掃描儀觀測(cè)照相，也可平鋪在普通掃描儀上掃描成圖像。凝膠圖像可通過(guò)電腦軟件進(jìn)行分析。確定目的蛋白的位置，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)條帶確定蛋白質(zhì)的相對(duì)大小。并可以通過(guò)軟件計(jì)算不同泳道之間蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。SDS凝膠電泳的Q&AQ：SDS電泳凝膠中各主要成分的作用？A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.8，分離膠選擇pH8.8，選擇Tris－HCL系統(tǒng)，具體作用后面介紹；Q：TEMED與AP的作用？A：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；Q：十二烷基硫酸鈉（SDS）的作用？A：陽(yáng)離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。Q：提高SDS電泳分辨率的途徑？A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊(cè)》P82-103。Q：什么是“鬼帶”，如何處理？A：“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過(guò)程中被氧化而失去活性，致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見(jiàn)其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。

處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來(lái)阻止還原劑的氧化。Q：為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？A：我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來(lái)的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。

處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。Q：為什么電泳的條帶很粗？A：電泳中條帶很粗是常見(jiàn)的事，主要是未濃縮好的原因。

處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長(zhǎng)度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.8）；適當(dāng)降低電壓；