DNSAA雙向聚酰胺薄膜層析1課件

DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析一般性實(shí)驗(yàn)-4背景層析法也稱(chēng)色譜法，是1906年俄國(guó)植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過(guò)裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開(kāi)，由此得名為“色譜法”（Chromatography)。后來(lái)無(wú)色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。英國(guó)生物學(xué)家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。1944年出現(xiàn)紙層析以后，層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層層析、親和層析、凝膠層析、氣相層析、高壓液相層析等。葉綠素通過(guò)碳酸鈣管柱所形成的色譜圖按層析過(guò)程的機(jī)理分類(lèi)：分配層析:

根據(jù)不同組分在不同溶劑中分配系數(shù)不同而使物質(zhì)分離的方法稱(chēng)為分配層析。吸附層析:吸附是兩相成一界面，溶質(zhì)在表面密集的現(xiàn)象。以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)稱(chēng)為吸附層析。常用吸附劑：活性碳、硅。離子交換層析:

是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)酸堿度、極性和分子大小差異而將物質(zhì)予以分離的一種方法。凝膠層析（分子篩）利用凝膠顆粒形成具有三維空間多孔性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，不帶電荷，可起濾過(guò)或“篩”的作用。親和層析是利用生物分子間所具有的專(zhuān)一性親和力的層析技術(shù)。層析法分類(lèi)層析法分類(lèi)按兩相所處的狀態(tài)分類(lèi)：流動(dòng)相有兩種狀態(tài)：液體作為流動(dòng)相氣體作為流動(dòng)相固定相也有兩種狀態(tài)：固體吸附劑作為固定相以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的狀態(tài)分為：液相層析和氣相層析流動(dòng)相固定相液體（液相層析)氣體（固相層析）液體液-液層析氣-液層析固體液-固層析氣-固層析層析法分類(lèi)名稱(chēng)操作形式適用范圍柱層析將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。柱層析是常用的層析形式，適用于大量樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。薄層層析將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開(kāi)，使各組份分離薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測(cè)分析和少量分離制備，通常為一次性使用。按操作形式不同分類(lèi)：吸附層析原理：任何兩個(gè)相都可以形成表面，其中一個(gè)相的物質(zhì)或溶解在其中的溶質(zhì)在此表面密集現(xiàn)象稱(chēng)為吸附，利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)具有不同吸附力使混合物得到分的現(xiàn)象就叫吸附層析。凡能將其他物質(zhì)聚集到自己表面的物質(zhì)稱(chēng)吸附劑，包括硅皮、氧化鋁、活性炭、淀粉、纖維素及陶土，而聚集于聚集于吸附劑表面的物質(zhì)稱(chēng)被吸附劑。吸附劑與被吸附劑之間的作用除了物理作用外，還有化學(xué)作用，如DNS-氨基酸雙向聚酰胺薄膜層析時(shí)中被分離的物質(zhì)之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之間形成氫鍵。分配層析技術(shù)分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中分配的數(shù)量多，移動(dòng)快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相中分配的數(shù)量多，移動(dòng)慢。因此可彼此分開(kāi)。分配系數(shù)主要與下列因素有關(guān)：①被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)；②固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)；③層析柱的溫度。相關(guān)的概念（一）：分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在固定相和流動(dòng)相兩相內(nèi)的濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱(chēng)為分配系數(shù)(Kd)。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)Kd=Cs/Cm

其中Cs:固定相中的濃度，Cm:流動(dòng)相中的濃度分配層析技術(shù)相關(guān)的概念（二）：遷移率：在一定條件下，在相同的時(shí)間內(nèi)某一組分在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相本身移動(dòng)的距離之比值。常用Rf來(lái)表示。物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，Rf值也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)。Rf=色斑中心至原點(diǎn)中心的距離溶劑前緣至原點(diǎn)中心的距離親和層析示意圖離子交換層析離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類(lèi)不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過(guò)一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。離子交換劑包括交換樹(shù)脂和交換纖維素兩種。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合，形成一個(gè)帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱(chēng)為陽(yáng)離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱(chēng)為陰離子交換劑。原理聚酰胺薄膜層析是一類(lèi)特殊的分配層析?；旌衔镫S流動(dòng)相通過(guò)聚酰胺薄膜時(shí)，由于被分離物質(zhì)與薄膜形成氫鍵，而各物質(zhì)形成氫鍵的能力不同，決定吸附力的差異，吸附力強(qiáng),展層速度慢，吸附力弱，展層速度快。展層溶劑與被分離物質(zhì)在聚酰胺離子表面競(jìng)爭(zhēng)形成氫鍵，選擇適當(dāng)?shù)恼箤尤軇?，使被分離物質(zhì)在溶劑與聚酰胺薄膜表面之間的分配系數(shù)有最大差異。易溶于展層劑的所受的動(dòng)力作用大，展層速度快，反之，速度慢。

DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析實(shí)驗(yàn)操作DNS-氨基酸的制備（已完成）混合DNS－氨基酸的雙向?qū)游鳇c(diǎn)樣：在薄膜右下角距兩邊各0.6cm，直徑控制在2～3mm之間，點(diǎn)在無(wú)光澤面，可重復(fù)點(diǎn)樣2-3次；苯－冰醋酸層析：將點(diǎn)好樣品的薄膜用回形針固定放入展層劑中，展層劑前緣在距薄膜頂端2mm處即可停止,冷風(fēng)吹干，紫外燈下觀(guān)察；甲酸－水層析：調(diào)轉(zhuǎn)90度與第一相垂直，放入展層劑中，熱風(fēng)吹干，紫外燈下觀(guān)察，用鉛筆輕輕標(biāo)記（以免損壞薄膜表面）；分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；將層析后標(biāo)記好的薄膜以點(diǎn)樣點(diǎn)