第七章外源基因表達

第七章外源基因表達第一頁，共50頁。第一節(jié)外源基因在原核細胞中的表達1.原核生物基因表達的特點

與真核細胞相比，原核細胞的基因表達有以下特點：（1）原核生物只有一種RNA聚合酶（真核細胞有三種）識別原核細胞的啟動子，催化所有RNA的合成。（2）原核生物的基因表達是以操縱子為單位的。（3）由于原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進行的。（4）原核基因一般不含有內(nèi)含子，在原核細胞中缺乏真核細胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。（5）原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對第二頁，共50頁。基因產(chǎn)物的直接控制要慢。（6）在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點上，含有一個轉(zhuǎn)譯起始密碼子及16S核糖體RNA3’末端堿基互補的序列，即S-D序列，而真核基因則缺乏此序列。2.原核表達系統(tǒng)的注意事項

從上述特點可以看出，欲將外源基因在原核細胞中表達，必須考慮表達載體、外源基因的性質(zhì)、原核細胞的啟動子和S-D序列、閱讀框架及宿主菌調(diào)控系統(tǒng)等基本條件，也就是說必須滿足以下條件：（1）通過表達載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指導宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白。（2）外源基因不能帶有內(nèi)含子，因而必須用cDNA或化學合成第三頁，共50頁。的基因，而不能用基因組DNA。（3）必須利用原核細胞的強啟動子和S-D序列等調(diào)控元件控制外源基的表達。（4）外源基因與表達載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架。（5）利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達，防止外源基因的表達產(chǎn)物對宿主菌的傷害。3.原核生物基因表達的調(diào)控序列

只有在了解了原核生物基因表達調(diào)控序列的基礎上，才能夠構(gòu)建高效的表達載體，使外源目的基因在原核細胞中得到高效率、高水平地表達。對于原核細胞來講，基因表達的調(diào)控序第四頁，共50頁。列主要涉及啟動子、S-D序列、終止子、增強子、衰減子等序列。（1）啟動子啟動子(promoter)是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調(diào)控序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。原核生物的啟動子是由兩段彼此分開且高度保守的核苷酸序列組成?！?35區(qū)（TTGACA）：位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游的-35bp附近，是RNA聚合酶初始識別和結(jié)合位點。■-10區(qū)（Pribnow框，TATAAT）：RNA聚合酶結(jié)合于此處導致DNA雙鏈形成單鏈。第五頁，共50頁。原核表達系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的強啟動子有l(wèi)ac（乳糖啟動子）、trp（色氨酸啟動子）、PL及PR（λ噬菌體左向和右向啟動子）、tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子）等。（2）終止子在一個基因或一個操縱子的3’端往往有一個特定的核苷酸序列，它有終止轉(zhuǎn)錄的功能，這一段DNA序列稱為終止子（terminator)。終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域，G/C區(qū)域具有回文對稱結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄后的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄終止作用類型，終止子可分為兩種：依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止子及不依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止子。第六頁，共50頁。（3）S-D序列S-D序列是位于起始密碼子（AUG）上游3~10bp處的由3~9bp組成的序列。這段序列正好與16SrRNA3’端序列互補，是rRNA的識別和結(jié)合位點。S-D序列存在與否及S-D序列與起始密碼子之間的距離，是影響mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的主要因素之一。（4）增強子增強子（enhancer)是能夠增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列。第七頁，共50頁。4.幾種類型的原核表達載體

在原核細胞中表達外源基因時，由于實驗設計的不同，總的來說可以產(chǎn)生融合型和非融合型表達蛋白。不與細菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達蛋白稱為非融合蛋白。融合蛋白指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其它DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。（1）非融合型表達蛋白載體pKK223-3具有一個強的tac（trp-lac）啟動子，這個啟動子是由trp啟動子的-35區(qū)、lacUV5啟動子的-10區(qū)、操縱基因及S-D序列組成。緊接著tac啟動子的是一個取自pUC8的多位點接頭，使之很容易把目的基因定位在啟動子和S-D序列之后。第八頁，共50頁。在多位點下游的一段DNA序列中，還包含一個很強的rrnB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。載體的其余部分由pBR322組成。（2）分泌型克隆表達載體pINIII系統(tǒng)這個載體系統(tǒng)是由pBR322為基礎構(gòu)建的。帶有大腸桿菌最強的啟動子之一，即Ipp（脂蛋白基因）啟動子。在啟動子的下游裝有l(wèi)acUV5的啟動子及其操縱基因，并把lac阻遏子的基因（lacI）也克隆到這個質(zhì)粒上。這樣目的基因的表達就成為可調(diào)節(jié)的了。在轉(zhuǎn)錄控制的下游再裝上人工合成的高效翻譯起始序列（S-D序列及ATG）。信號肽序列取自于大腸桿菌中分泌蛋白的基因ompa（外膜蛋白基因）。第九頁，共50頁。在編碼序列的下游緊接著一段人工合成的多克隆位點片斷，包括三個單一酶切位點，EcoRI、HindIII、BamHI。（3）融合蛋白表達載體pGEX系統(tǒng)載體的組成成分基本上與其它表達載體相似，含有啟動子tac及l(fā)ac操縱基因、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因等。這類載體與其它表達載體不同之處在于S-D序列下游是谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶基因，而克隆的外源基因則與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶基因相連。當進行基因表達時，表達產(chǎn)物為谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和目的基因產(chǎn)物的融合蛋白。第十頁，共50頁。5.外源基因在大腸桿菌中的表達部位

（1）不同表達部位克隆在大腸桿菌中的外源基因，它們的編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)，有的是在細胞質(zhì)中表達，有的是在細胞周質(zhì)中表達，還有的則是以分泌到細胞外的方式表達?！黾毎|(zhì)中表達大腸桿菌細胞質(zhì)中表達的外源蛋白，大多是以包含體的形式存在的。包含體是存在于細胞質(zhì)中的一種由不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)?！鲋苜|(zhì)中表達周質(zhì)是指在大腸桿菌一類格蘭氏陰性細菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細胞結(jié)構(gòu)部分。周質(zhì)中表達的蛋白需要在信號肽的引第十一頁，共50頁。導下才能穿越內(nèi)膜，進入細胞周質(zhì)?！黾毎獗磉_表達的外源蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中，同樣需要信號肽序列的引導。（2）不同部位表達外源蛋白的優(yōu)缺點第十二頁，共50頁。表達部位優(yōu)點缺點細胞質(zhì)1、形成包涵體（a）蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度的方式分離（b）蛋白質(zhì)受保護而免受胞內(nèi)酶的降解作用（c）蛋白質(zhì)沒有活性，因此不會使寄主細胞受傷害2、蛋白質(zhì)產(chǎn)量高3、表達的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡單1、形成包涵體（a）蛋白質(zhì)折疊了，再折疊的蛋白質(zhì)可能無法恢復其生物學活性（b）蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低（c）蛋白質(zhì)生產(chǎn)成本比較昂貴2、還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成3、由于N-末端存在甲硫氨酸，使蛋白質(zhì)的真實性受到影響4、蛋白質(zhì)會被降解5、蛋白質(zhì)種類多，因此純化比較復雜周質(zhì)1、由于周質(zhì)中蛋白種類比較少，因此目標蛋白質(zhì)的純化就比較簡單2、蛋白質(zhì)降解的程度不甚嚴重3、促進了二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊作用4、蛋白質(zhì)的N-末端結(jié)構(gòu)真實1、信號肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運2、有可能形成包涵體胞外1、蛋白質(zhì)的降解作用程度最低2、由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類少，因此目標蛋白質(zhì)容易純化3、增進了蛋白質(zhì)的折疊作用4、蛋白質(zhì)的N-末端結(jié)構(gòu)真實1、在大腸桿菌中表達的外源真核蛋白質(zhì)，通常是不會分泌到胞外培養(yǎng)基中去的2、由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當稀釋，因此目標蛋白質(zhì)的純化過程比較復雜表7.1不同部位表達外源蛋白的優(yōu)缺點第十三頁，共50頁。6.影響外源基因表達效率的因素及提高表達水平常用的方法

（1）啟動子結(jié)構(gòu)對表達效率的影響原核生物啟動子有兩種保守序列，即-35區(qū)的TTGACA序列和-10區(qū)的TATAAT序列。研究發(fā)現(xiàn)，啟動子的強度與一致序列的相似程度成正比。進一步的研究表明，-35和-10區(qū)的距離也是一個重要因素。如果間隔為17個堿基對，啟動子表現(xiàn)很強，如果大于17個堿基對，啟動子表現(xiàn)較弱。根據(jù)這些原理，Amann等克隆了tac啟動子（lac-trp），促進了克隆基因的表達。（2）轉(zhuǎn)譯起始序列對表達效率的影響第十四頁，共50頁。S-D序列的保守性、S-D序列后面的4個堿基成分以及起始密碼子AUG左側(cè)的密碼三聯(lián)體的堿基組成都會影響到外源基因的表達效率。如：UAAGGAGG比GGAGG高3～6倍（表達水平)SD與AUG間富含AT有利于翻譯AUG左側(cè)的密碼三聯(lián)體為UAU或CUU時，轉(zhuǎn)譯最為有效；如果是UUC、UCA或AGG時，轉(zhuǎn)譯水平將下降20倍。（3）啟動子同克隆基因間的距離對表達效率的影響啟動子同克隆基因間的距離對表達效率的影響，主要是由于mRNA的5’末端形成不同的二級結(jié)構(gòu)，從而影響mRNA的翻譯效率。根據(jù)上述原理，要提高克隆基因的表達效率，可采用構(gòu)建克第十五頁，共50頁。隆庫的辦法。在庫中，將外源基因分別放置在離啟動子遠近不同的地方。轉(zhuǎn)化后，篩選重組克隆，從中篩選出外源基因表達最強的克隆。（4）轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對克隆基因表達效率的影響克隆基因的末端是否存在轉(zhuǎn)錄終止區(qū)也會影響到克隆基因的表達效率。其原因可能為：若干非必須的轉(zhuǎn)錄本的合成，會使細胞消耗巨大的能量用于制造大量非必須的蛋白質(zhì)。在轉(zhuǎn)錄本上有可能出現(xiàn)一些不期望出現(xiàn)的二級結(jié)構(gòu)，從而降低了轉(zhuǎn)譯的效率。因此，在構(gòu)建表達載體時，在克隆基因后面安裝一個強轉(zhuǎn)錄第十六頁，共50頁。終止子（如rrnB終止子）對完全終止轉(zhuǎn)錄是必要的，可以阻止通讀，增加基因表達。（5）質(zhì)粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達效率的影響由于細胞中的核糖體數(shù)量，與任何一種mRNA分子數(shù)目相比，都是大大超量的，因此，提高克隆基因表達效率的途徑之一，是增加相應的mRNA分子數(shù)量。為此，須增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)及其穩(wěn)定性。一般采用松弛型質(zhì)粒構(gòu)建外源基因的表達載體，從而達到增加質(zhì)粒及外源基因拷貝數(shù)的目的。質(zhì)粒載體中含有分配功能區(qū)par，能保證質(zhì)粒分子在每次細胞周期中都能準確地進行分離，并均等地分配到子代細胞中去，從而達到穩(wěn)定質(zhì)粒拷貝數(shù)的作用。第十七頁，共50頁。（6）mRNA的穩(wěn)定性對表達效率的影響原核生物的mRNA分子的降解速度很快，一般在幾秒~幾分之間。因此，維持外源基因mRNA的穩(wěn)定性可提高其表達效率。一般的作法是給外源基因mRNA的5’及3’端安裝某些結(jié)構(gòu)序列，保護mRNA不能被降解。如：3’端莖環(huán)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄終止子結(jié)構(gòu)；E.coliompA轉(zhuǎn)錄物的5’非翻譯部分可作為mRNA的穩(wěn)定劑。（7）遺傳密碼子的使用對表達效率的影響無論是真核基因還是原核基因，一種特定的氨基酸并不是以等同的頻率使用所有的同義密碼子，而是使用其中的某一兩種。我們將這種遺傳密碼子使用的非隨機性現(xiàn)象，稱為密碼子使用偏愛性，簡稱密碼子偏愛性。第十八頁，共50頁。選擇和使用大腸桿菌偏愛密碼子有利于增加外源基因在大腸桿菌中的翻譯效率，從而提高外源基因的表達效率。（8）寄主細胞的生理狀態(tài)對基因表達效率的影響大腸肝菌寄主細胞的生理狀態(tài)，會或多或少地影響外源基因的表達效率，諸如：培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的選擇、細胞培養(yǎng)的方式，以及培養(yǎng)的溫度和培養(yǎng)基中所溶解的氧的數(shù)量等環(huán)境參數(shù)。不過，有關(guān)處于不同生理狀態(tài)下的大腸桿菌寄主細胞，究竟是怎樣影響外源基因的細胞效率的，人們在這方面的知識還是相當貧乏的。第十九頁，共50頁。圖7.1原核細胞的啟動子序列

第二十頁，共50頁。圖7.2原核基因轉(zhuǎn)錄的起始

第二十一頁，共50頁。圖7.3原核基因終止子序列及其結(jié)構(gòu)

第二十二頁，共50頁。圖7.4非融合型表達蛋白載體pKK223-3第二十三頁，共50頁。圖7.5分泌型克隆表達載體pINIII系統(tǒng)第二十四頁，共50頁。圖7.6融合蛋白表達載體pGEX系統(tǒng)第二十五頁，共50頁。圖7.74個天然啟動子和兩個人造啟動子的-35區(qū)和-10區(qū)的堿基序列第二十六頁，共50頁。圖7.8三個重組質(zhì)粒的cromRNA二級結(jié)構(gòu)第二十七頁，共50頁。圖7.9改變Lac啟動子和克隆基因間距離的一般方法第二十八頁，共50頁。第二節(jié)外源基因在真核細胞中的表達1.酵母表達系統(tǒng)

酵母（yeast）是一類以芽殖或裂殖進行無性繁殖的單細胞真核生物，是最理想的真核生物基因表達系統(tǒng)。（1）酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點基因表達調(diào)控的機制比較清楚，遺傳操作相對簡便。具有原核生物所不具備的蛋白質(zhì)翻譯后的加工和修飾系統(tǒng)?？蓪⑼庠椿虮磉_產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。對人體和環(huán)境安全，不含毒素和特異性病毒?？蛇M行大規(guī)模的發(fā)酵，工藝簡單而成熟，成本低廉。第二十九頁，共50頁。（2）酵母基因表達載體酵母克隆和表達載體是由酵母野生型質(zhì)粒、原核生物質(zhì)粒載體上的功能基因（如抗性基因、復制子等）和宿主染色體DNA上的自主復制子結(jié)構(gòu)（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（LEL）等一起構(gòu)建而成。酵母基因表達系統(tǒng)的載體一般是一種穿梭質(zhì)粒，它既能夠在原核細胞（大腸桿菌）中復制，又能在真核細胞（酵母）中復制。■DNA復制起始區(qū)a：大腸桿菌源質(zhì)粒的復制起始序列：使其能在大腸桿菌中復制。b：酵母菌的天然2μ質(zhì)粒的復制起始序列或酵母基因組中的自主復制序列，使其能在酵母菌中復制。第三十頁，共50頁?！鲞x擇標記基因a：營養(yǎng)缺陷型選擇標記，宿主菌為相應的營養(yǎng)缺陷型。b：顯性選擇標記（G418等），可采用各種類型酵母細胞作為宿主細胞?！鲇薪z分裂穩(wěn)定區(qū)

來源于酵母染色體著絲粒（centromere）片斷，能保證表達載體在酵母細胞分裂時，能平均地分配到子代細胞中去?！霰磉_盒

表達盒是酵母表達載體的重要元件，包括啟動子、分泌信號肽序列、多克隆位點及終止子序列。啟動子：保證轉(zhuǎn)錄的起始。分泌信號肽序列：引導目的基因蛋白分泌到細胞外。第三十一頁，共50頁。多克隆位點：供外源基因插入。終止子：保證轉(zhuǎn)錄在適當位置停止。（3）酵母基因表達載體的種類■自主復制型質(zhì)粒載體該質(zhì)粒含有酵母基因組的DNA復制起始區(qū)、選擇標記、基因克隆位點等關(guān)鍵元件。酵母基因組DNA復制起始區(qū)：能夠在酵母細胞中自主復制。基因克隆位點：來源于大腸桿菌源質(zhì)粒，如pBR322。這類載體的優(yōu)點在于：在酵母細胞中的轉(zhuǎn)化率高，每個細胞拷貝數(shù)可達200個缺點在于：由于缺乏酵母染色體著絲粒片斷，在細胞分裂過程中不能均勻的分配到子細胞中去，因而經(jīng)過多代培養(yǎng)后，子細第三十二頁，共50頁。胞中質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)迅速減少?！稣闲唾|(zhì)粒載體該質(zhì)粒載體不含有酵母DNA復制起始區(qū)，不能在酵母中進行自主復制，但該質(zhì)粒含有整合介導區(qū)，可以通過DNA的同源重組將外源基因整合到酵母染色體上，隨染色體一起進行復制?！鲋z粒型質(zhì)粒載體該質(zhì)粒載體是在自主復制型質(zhì)粒載體的基礎上構(gòu)建而成的，增加了酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件（著絲粒），因而能保證質(zhì)粒載體在細胞分裂時平均地分配到子細胞中去，同時提高了質(zhì)粒在宿主細胞中的穩(wěn)定性?！鼋湍溉斯と旧w第三十三頁，共50頁。（4）酵母基因表達系統(tǒng)宿主菌目前，作為外源基因表達的宿主酵母菌主要包括：釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、乳酸克努維酵母和多形漢森酵母。（5）在酵母中高效表達外源基因的策略■提高表達載體在細胞中的拷貝數(shù)以多拷貝酵母內(nèi)源性質(zhì)粒為基礎構(gòu)建的多拷貝表達載體，是提高表達載體在酵母中拷貝數(shù)的一個途徑。但以上的多拷貝載體在沒有選擇壓力的情況下，可能難以保持其高拷貝數(shù)。將外源基因整合到染色體上可維持外源基因在細胞中的穩(wěn)定性，然而在多數(shù)情況下會因為在細胞中的拷貝數(shù)較低而影響其表達。第三十四頁，共50頁?！鎏岣咄庠椿虻霓D(zhuǎn)錄水平在構(gòu)建表達載體時組入強啟動子，如：酵母磷酸甘油酯激酶基因啟動子、甘油醛磷酸脫氫酶基因啟動子，可提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。但外源基因表達的產(chǎn)物量過高也會對細胞形成傷害?！鲞x擇合適的受體細胞系統(tǒng)根據(jù)表達載體特性，選擇合適的酵母受體系統(tǒng)。第三十五頁，共50頁。2.植物細胞基因表達系統(tǒng)

（1）植物基因表達載體的組成特性大多數(shù)植物基因表達載體是以Ti質(zhì)粒為基礎構(gòu)建而成的，其組成包括啟動子、T-DNA、終止子、內(nèi)含子及選擇標記基因和報告基因。■植物基因表達載體的啟動子根據(jù)啟動子的功能和作用方式，可分為組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異性啟動子等幾類。組成型啟動子：外源基因的表達大體恒定在一定水平，在不同組織部位沒有明顯差異，沒有時空特異性。一般采用花椰菜花葉病毒（CaMV）35SRNA的啟動子、Ti質(zhì)粒的胭脂堿合成酶基因(nos)或章魚堿合成酶基因(ocs)的啟動子。第三十六頁，共50頁。誘導型啟動子：在某些特定的物理或化學信號刺激下，可大幅度提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。組織特異型啟動子：外源基因只能在特定的組織細胞中表達。如：采用馬鈴薯塊莖蛋白基因的啟動子、花粉特異表達基因啟動子等?！鲋参锘虮磉_載體的終止子不同來源的終止子對外源基因的表達有很大影響，它不僅決定外源基因的轉(zhuǎn)錄活性，也決定mRNA在細胞中的穩(wěn)定性，從而影響mRNA的翻譯。研究表明，采用相同的啟動子及外源基因，而采用不同的終止子序列，外源基因的表達水平有很大差異（差異可達60倍）?！鯰-DNA（transferDNA）第三十七頁，共50頁。可將外源基因連入T-DNA區(qū)域，隨T-DNA隨機整合進入植物細胞的染色體基因組中，從而使外源基因得到穩(wěn)定維持和表達。但必須注意保留T-DNA序列的左右邊界序列，因為左右邊界序列是外源DNA轉(zhuǎn)移和整合不可缺少的元件。■內(nèi)含子序列研究表明，內(nèi)含子與基因表達水平有很大關(guān)系。因而在構(gòu)建植物基因表達載體時，可根據(jù)不同基因的類型，有選擇性的插入內(nèi)含子序列?！鲞x擇標記基因和報告基因選擇標記基因和報告基因的作用在于篩選轉(zhuǎn)化體，檢測外源基因的轉(zhuǎn)譯水平。常用的選擇標基因有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、二氫葉酸還原酶基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因等；報告基因有冠癭堿基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等。第三十八頁，共50頁。（2）植物基因表達的受體系統(tǒng)植物基因表達的受體系統(tǒng)是指用于轉(zhuǎn)化的植物細胞，主要包括以下五類：■愈傷組織再生系統(tǒng)它是外植體經(jīng)脫分化培養(yǎng)、誘導愈傷組織并通過分化培養(yǎng)獲得再生植株的受體系統(tǒng)。特點：易于接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率高；擴繁量大，可獲得大量的轉(zhuǎn)化植株；但獲得的再生植株無性系變異較大；外源基因的穩(wěn)定性差?！鲋苯臃只偕到y(tǒng)它是指外植體細胞不經(jīng)脫分化階段而直接分化出不定芽而獲得再生株。第三十九頁，共50頁。特點：獲得再生植株的周期短，細胞無性系變異小，能較好地保持受體細胞的遺傳穩(wěn)定性；但轉(zhuǎn)化率相對較低，存在較多的嵌合株?！鲈|(zhì)體再生系統(tǒng)特點：轉(zhuǎn)化率高，可形成基因型一致的細胞克?。坏|(zhì)體培養(yǎng)周期較長、難度大、再生頻率較低，在原生質(zhì)體的培養(yǎng)過程中易造成變異?！雠郀铙w再生系統(tǒng)它是指體細胞或單倍體細胞在組織培養(yǎng)條件下誘導成為形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上類似于有性胚的胚狀體，是一種最理想的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。特點：轉(zhuǎn)化率高；獲得嵌合體少；可生產(chǎn)人工種子。第四十頁，共50頁?！錾臣毎荏w系統(tǒng)以生殖細胞如花粉、卵細胞等作為基因轉(zhuǎn)化的受體細胞，通過組織培養(yǎng)技術(shù)將生殖細胞誘導成為胚性細胞或愈傷組織，或直接利用花粉和卵子受精過程進行基因轉(zhuǎn)化。特點：轉(zhuǎn)化率高；易于獲得穩(wěn)定的遺傳，并且通過加倍后成為純合的二倍體。（3）提高外源基因在植物細胞中的表達效率的策略■構(gòu)建高效表達的轉(zhuǎn)化載體■防止外源基因失活■優(yōu)化先導序列，提高翻譯效率第四十一頁，共50頁。3.哺乳動物細胞基因表達系統(tǒng)

（1）哺乳動物基因表達載體的組成特性哺乳動物基因表達載體一般包括：■在哺乳動物細胞中進行基因轉(zhuǎn)錄的元件，即轉(zhuǎn)錄的啟動子、終止子、poly(A)信號和內(nèi)含子剪接信號。

啟動子：主要來源于病毒，如：SV40的早期和晚期轉(zhuǎn)錄啟動子、腺病毒晚期啟動子等。也可選用某些真核基因的啟動子，如：鼠細胞的金屬硫蛋白基因啟動子（可達到誘導表達的目的）等。

終止子和poly（A）：常用的poly（A）及終止子信號來自SV40。第四十二頁，共50頁。

內(nèi)含子剪接信號：如果采用cDNA，沒有內(nèi)含子，因而也不需要相應的內(nèi)含子序列。如果采用基因組DNA，需要內(nèi)含子剪接信號將相應的內(nèi)含子去除。剪接點之間的距離及剪接點周圍的序列會影響到剪接效果。同時，基因中組入一個合適的內(nèi)含子有時會提高外源基因的表達水平?！鲇糜诤Y選轉(zhuǎn)化子的選擇標記基因

一般采用胸苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因等作為哺乳動物轉(zhuǎn)化細胞的篩選標記基因?！鲈诩毦羞M行復制和篩選的元件使表達載體能夠在原核細胞中進行大量復制，經(jīng)篩選獲得陽性克隆子，后者經(jīng)大量培養(yǎng)可提取出大量含外源基因的表達載體，最后用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導哺乳動物受體細胞。第四十三頁，共50頁?！龌虮磉_的調(diào)控元件

如：增強子可提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平，而衰減子的作用恰恰相反，降低了外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。（2）哺乳動物基因表達載體■不帶真核復制起始序列的質(zhì)粒型載體

該類載體只含原核復制子，質(zhì)粒載體被轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞后不能以附加體的形式復制，而是被整合到宿主細胞的基因組中，并在基因組的調(diào)控