DNA重組技術(shù)課件

植物基因工程原理第二章DNA重組技術(shù)Chapter2DNARecombinationTechnology

DNA重組技術(shù)又稱為基因工程（geneengineering）或分子克隆(molecularcloning)。是指通過一系列的實驗技術(shù)，最終將一個生物體中的遺傳信息(DNA)轉(zhuǎn)入另一個生物體。1973年由美國加利福尼亞的S.Cohen和N.Boyer首次完善DNA重組，并得到驗證。植物基因工程原理第二章

重組DNA技術(shù)西南大學西南大學①載體和目的基因的分離；②載體和目的基因的酶切；③載體和目的基因的重組；④重組DNA的轉(zhuǎn)化和擴增；⑤重組DNA的篩選和鑒定。西南大學西南大學§2常用工具酶構(gòu)建重組的DNA分子時，需要對DNA分子進行切割、修飾和連接等一系列操作，離不開酶。在DNA生化特性分析、基因的結(jié)構(gòu)分析和基因的表達調(diào)控研究中，都需要高度純化的酶。西南大學西南大學依酶催化反應的類型分為4大類：核酸酶：用于切割或降解核酸分子。連接酶：用于連接核酸分子。聚合酶：用于合成核酸分子。修飾酶：用于給核酸分子加上或減去某些化學基團或核苷酸這4種酶大都是從細菌和噬菌體中純化的。在細胞中它們原本就參與DNA復制和轉(zhuǎn)錄、降解外來DNA分子、修飾突變的DNA分子、DNA分子間的重組等一系列重要的生命反應過程。西南大學西南大學一、核酸酶（nuclease)凡是能水解核酸的酶都稱為核酸酶。核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)降解RNA分子成核苷酸。用于清除DNA制備物中的污染的RNA分子，如RNaseA,B;RNaseH等。降解DNA分子成核苷酸。核酸外切酶(exonuclease)3’5’:如E.coli外切酶III,3’5’和5’3’:如Bal31,非限制性核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶(endonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶)(Restrictionendonuclease)在DNA分子內(nèi)部、不識別特定的序列、任意位置、隨即切割。如S1內(nèi)切酶—切單鏈DNA或雙鏈上缺刻處的單鏈，牛胰腺DNAI—切割單鏈和雙鏈DNA具有識別特定DNA序列的特性。沒有限制酶就沒有基因工程西南大學西南大學限制性內(nèi)切酶

(Restrictionendonuclease)類型II:識別位點和酶切位點一致，具特異性。

單體酶，性質(zhì)穩(wěn)定，Mg2+為輔助因子。目前已分離了數(shù)百種。類型I:識別的DNA序列長約十幾個bp;酶切位點在識別位點1000kb左右，非特異性;復合酶，可在雙鏈上甲基化，同時具有限制和修飾功能，需ATP,Mg2+等S-腺苷甲硫氨酸為輔因。如EcoB,EcoK。類型Ⅲ:酶切位點在識別位點附近或相鄰位置，非特異性。單體酶，如HgaI:GACGCnnnnn西南大學西南大學1.類型II限制性內(nèi)切酶的特點①類型IIRE一般都很穩(wěn)定，只需Mg+2作為輔助因子，因此，加0.5Mol/LEDTA絡合,可終止反應。識別序列的長短不一4bp:GATCSau3A(Staphylococcusaureus3A)TCGATaqI(Thermusaquoticus)5bp,6bp,7bp,8bp,9bp,……32bp…②識別序列具有回文結(jié)構(gòu)。

EcoRIGAATTCCTTAAG西南大學西南大學類型II限制性內(nèi)切酶的特點③酶切后末端有3種GAGCTCCTCGAGEcl136IIGAGCTCCTCGAG平端(bluntterminus)粘端(stick/cohesiveterminus)5’突出末端3’突出末端GAATTCCTTAAGEcoRIGAATTCCTTAAGCTGCAGGACGTCPstICTGCAGGACGTC西南大學西南大學類型II限制性內(nèi)切酶的特點④酶識別序列的對稱與不對稱對稱識別序列不對稱識別序列CCAGGGGTCCEcoRIIGAATTCCTTAAGEcoRICCAGGGGTCCGGTCCCCAGGCCAGGGGTCCCCAGGGGTCCGGACCCCTGGGGTCCCCAGGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG西南大學西南大學類型II限制性內(nèi)切酶的特點⑤同裂酶：⑥同位異裂酶有些酶識別位點相同，但切割位點不同HindIII和HsuIAAGCTTTTCGAAGAGCTCCTCGAGSacI和SstIGAGCTCCTCGAGSacIGAGCTCCTCGAGEcl136IISmaICCCGGGXmaICCCGGG西南大學西南大學類型II限制性內(nèi)切酶的特點⑦同尾酶：識別位點不同，但切割后產(chǎn)生相同末端BamHIGGATCCBglIIAGATCTBclITGATCASau3AGATCGATC可以用不同的酶，切出相同的粘性末端，便于重組，但重組后不能再被該酶切開。西南大學西南大學對一個特定的RE,在一個已知列的DNA上的酶切位點序數(shù)目可以用數(shù)學方法來推算或預測。如：Sau3AGATC4n=44=256bp,即每256個堿基對可能出現(xiàn)一個Sau3A酶切位點。GGNCC4n=45=1025bpAGATCT4n=46=4096bp該公式建立在2個假設上，（1）核苷酸隨即排列，（2）四個核苷酸含量相同。西南大學西南大學溫度：標準溫度為37℃，但SmaI為30℃，TaqI為65℃2.限制酶酶切DNA的條件緩沖系統(tǒng)(Buffer)：Tris-Cl離子種類和濃度：Mg+2為輔因，Na+或K+

DNA樣品的純度：污染有酚、氯仿、SDS、蛋白時酶切難酶穩(wěn)定劑：DTT(二硫蘇糖醇)、-巰基乙醇

DNA的甲基化程度非最適時，酶識別特異性降低，表現(xiàn)為松弛的專一性，此現(xiàn)象為該酶的星活性(Staractivity)，即出現(xiàn)正常酶切位點之外的“額外”酶切活性。緩沖系統(tǒng)(Buffer)離子種類和濃度西南大學西南大學酶切反應體系和操作步驟（1）加樣（2）混勻，瞬間離心；（5）電泳分析，1.2%Agrose平板電泳，3～5V/cm,（3）37℃，2～2.5h；（4）65℃15min或0.5MEDTA或-20℃放置，終止酶反應。但HpaI,PvuI和TaqI65℃不能鈍化酶。ddH2O:加水至20l10xBuffer:2lDNA樣品：nlRE酶(10U/l)：mlTotal:20lOr:50l

100l西南大學西南大學RE酶切注意事項RE的1單位酶活性是指在最適溫度和緩沖體系條件下1h酶切1gλDNA的活性。具體實驗時可作為決定加入酶量的依據(jù).RE通常保存在50%甘油的貯存Buffer中，而甘油在RE反應體系中超過5%時就表現(xiàn)出抑制。故酶切反應時加入酶量不能超過反應體系的1/10。注意雙酶切。酶切時間與DNA純度和用量，及酶濃度有關(guān)。如果DNA樣品是結(jié)構(gòu)復雜的基因組DNA,酶切時間可延至18h,而PlasmidDNA的酶切時間較短。長時間切要注意酶切體積的變化。若電泳分析時嫌酶切產(chǎn)物的體積過大，則可先用乙醇沉淀濃縮DNA，再電泳。

西南大學西南大學二、連接酶T4DNAligase:連接粘端和平端，缺刻E.coliDNAligase:連接粘端缺刻T4RNAligase:作用于單鏈的RNA之間，單鏈的DNA之間，單鏈的RNA和DNA之間。不連接單鏈西南大學西南大學T4DNAligase:連接粘端和平端、缺刻，不連接單鏈。最佳連接溫度為37℃，但實際上，該溫度下粘端DNA分子形成的配對極不穩(wěn)定（因氫建作用力弱）。因此，連接溫度采用12-16℃。有的公司推薦20℃。如果連接點的C+G含量高，如SmaI位點，CCCGGG，可適當提高溫度以助連接。

西南大學西南大學三、聚合酶（polymerase）E.coliDNApolymeraseIRNApolymerase:SP6、T3、T7DNApolymeraseKlenowfragmentT4DNApolymeraseT7DNApolymeraseTaqDNApolymerasePfuDNApolymeraseTaqplusIDNApolymeraseReverseTranscriptase:AMV,M-MuLV依賴DNA西南大學西南大學5’1.DNA聚合酶以DNA為模板，催化合成互補的新鏈。多數(shù)需要一個引物。(1)E.coliDNApolymeraseI催化5’3’的DNA新鏈合成，同時具有5’3’的核酸外切酶活性，使DNA降解；有3’5’外切酶活性，使其具有校正功能。5’3’5’3’3’5’舊鏈被置換，在DNA標記中常用。西南大學西南大學1.DNA聚合酶(4)T7DNAPolymerase由2個亞基組成；催化新鏈合成；具有3’5’對單鏈和雙鏈起作用的外切酶活性。西南大學西南大學1.DNA聚合酶(5)TaqDNAPolymerase(Taq酶)具有耐95℃左右高溫達30min以上的特性；催化5’3’的DNA新鏈合成，最適溫度68～72℃，合成速度1200bases/min；

在合成的DNA鏈的3’端常多一個“A”；不具3’5’的外切酶活性,即無校正功能，大約每合成500個堿基要錯配一個；

具微弱的5’3’的DNA外切酶活性。5’5’3’AAAPCR用，有野生型和重組的西南大學西南大學1.DNA聚合酶(6)Pfu

高保真DNAPolymerase具有耐95℃左右高溫達30min以上的特性；催化5’3’的DNA新鏈合成，最適溫度68～72℃，合成速度600bases/min；

合成的DNA為平端,TA克隆時要用Taq酶加A；

合成的DNA片段長度在2kb以內(nèi)；具3’5’的外切酶活性,即有校正功能；無5’3’的DNA外切酶活性。西南大學西南大學1.DNA聚合酶(7)TaqPlusIDNAPolymerase具有耐95℃左右高溫達30min以上的特性；催化5’3’的DNA新鏈合成，68～72℃最適；

合成速度800bases/min；

可合成2-3kb的長DNA片段；合成的DNA為平端,TA克隆時要用Taq酶加A；

具3’5’的外切酶活性,有很強的校正功能，大約每合成1.6x106個堿基要錯配一個；

具微弱的5’3’的DNA外切酶活性。西南大學西南大學1.DNA聚合酶(8)逆轉(zhuǎn)錄酶(ReverseTranscriptase)均來源于RNA病毒。以RNA為模板，需引物，合成互補的DNA鏈。AAAATTTTAMV:禽源RT,來源于雞成髓細胞增多癥病毒(AvianMyeloblastosisvirus)最適溫度42℃；以RNA、DNA或RNA∶DNA雜分子為模板；需引物；需Mg2+或Mn2+為輔助因子；具有很強的RNaseH活性，特異性地對RNA∶DNA雜分子中的RNA降解。西南大學西南大學1.DNA聚合酶(8)逆轉(zhuǎn)錄酶(ReverseTranscriptase)M-MuLV:鼠源RT,來源于鼠白血病病毒(Moloney

MurineLeukemiaVirus)最適溫度42℃,以RNA、DNA或RNA∶DNA雜分子為模板，需引物，需Mg2+或Mn2+為輔助因子，具有RNaseH活性，特異性地對RNA∶DNA雜分子中的RNA降解。西南大學西南大學1.DNA聚合酶AMV和M-MuLV具有RNaseH酶活性，故合成的cDNA不是全長的。TTTTNaOHTTTTTTTTS1RNaseHTTTTAAAATTTTAAAAAAAAE.coliDNAPolI西南大學西南大學1.DNA聚合酶PowerscriptReverseTranscriptase

AAAACCCTTTTAAAACCCTTTTGGGAAAACCCTTTTGGGGGGCCCTTTTRNaseHCLONETECH公司的專利產(chǎn)品，源于M-MuLV的一個點突變。無RNaseH活性，故合成的cDNA不會因此變短。

具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，傾向加3個“C”。

用于合成全長cDNA。GGGCCCTTTTRTase西南大學西南大學2.RNA聚合酶RNApolymerase:合成RNA。SP6RNApolymerase:識別SP6phage啟動子Seq.T3RNApolymerase:識別T3phage啟動子Seq.T7RNApolymerase:識別T7phage啟動子Seq.用途:體外合成mRNA用作探針，進行Northern雜交體外無細胞翻譯，合成蛋白質(zhì)西南大學西南大學西南大學西南大學pGEM?-11Zf(+)Vectorpromoterandmultiplecloningsitesequence西南大學西南大學四、其它工具酶1.T4polynucleotidekinase2.PhosphataseBacterialAlkalinePhosphatase

CalfIntestineAlkalinePhosphatase

3.TerminalDeoxynucleotidyltransferase4.甲基化酶

5.RNaseH6.RNaseA7.S1nuclease8.DNA松弛酶(拓撲異構(gòu)酶)西南大學西南大學1.T4polynucleotidekinase5’OH

OH

P

P

5’3’3’5’OH

OH

5’3’3’OH

OH

T4polynucleotidekinaseATP5’OH

OH

P

P

5’3’3’5’kinase,對RNA、DNA5’OH基起作用，加磷酸(PO43-)基團.具3’磷酸酶(3-phosphotase)活性，去3’磷酸基團。T4polynucleotidekinase,3-phosphotaseminusT4多核苷酸激酶西南大學西南大學2.Phosphatase磷酸酶BacterialAlkalinePhosphatase（BAP）CalfIntestineAlkalinePhosphatase(CIAP)5’OH

OH

5’3’3’OH

OH

5’OH

OH

P

P

5’3’3’來源于E.colistrainC4不易失活，活性較低不常用。功能：催化RNA、DNA5’端游離磷酸基團水解脫落用途：去5’端磷酸基團，防基因重組時相同末端連接，尤其用于防止Vector自環(huán)化。來源于小牛小腸，活性高，常用。西南大學西南大學3.TerminalDeoxynucleotidyltransferase末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶dGTPGGGGGGGGGGG不可逆地加入同聚物加尾，用于基因重組時產(chǎn)生粘性末端。DNA西南大學西南大學4.甲基化酶

有多種甲基化酶。

對DNA甲基化dam---GATC---Sau3AIBclI,BamHICH3dcm-CCAGG-或-CCTGGCH3CH31st的C5引入甲基高等植物染色體的甲基化程度遠比細菌等低等生物的高。西南大學西南大學5.RNaseH功能：特異性地降解RNA:DNA雜交鏈中的RNA分子。用途：cDNA合成中（1）降解RNA:DNA雜交鏈中的RNA分子，便于cDNA第二鏈置合成；（2）在RNA:DNA雜交鏈中的RNA上隨即產(chǎn)生缺刻，便于cDNA第二鏈置換法合成。西南大學西南大學6.RNaseA常用于清除DNA提取物中混雜的RNA。Note:boiling5mintoremoveDNase.西南大學西南大學7.S1nuclease功能：切單鏈DNA成單個寡核苷酸。切雙鏈DNA分子中的缺口(gap)平端AAAAAAAATTTTTT--AAAAAAAATTTTTT--AMVRTase堿E.coliDNA聚合酶ITTTTTT--S1DNA^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^mRNAAMVRTaseTTTT--變性、退火S1分析內(nèi)含子分析轉(zhuǎn)錄起點(+1)

cDNAhairpin西南大學西南大學(8)DNA松弛酶(拓撲異構(gòu)酶)DNA松弛酶(拓撲異構(gòu)酶)在DNA上產(chǎn)生一個缺刻，使DNA解螺旋后再封閉。與DNAligase不同的是不需要ATP參與。用途:PCR產(chǎn)物的TA克隆，起連接酶的作用。如寶生物的pMT18-T載體連接試劑盒，

Invitrogen公司的pCRII-TOPO載體連接試劑盒.西南大學西南大學§2基因克隆載體基因工程中常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，注意不能破壞載體的自我復制性質(zhì)。如有利于進行篩選的標志基因、單一的限制酶切點等。西南大學西南大學基因克隆載體

載體結(jié)構(gòu)插入(kb）代表載體PlasmidPhagemidBacteriophageFosmidCosmidP1cloneMiniF-basedPlasmidPACBACYACMACBiBAC質(zhì)粒

噬菌體

粘粒

P1衍生的人工染色體細菌人工染色體酵母人工染色體哺乳動物人工染色體雙元細菌人工染色體環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒線狀DNA環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒線狀DNA環(huán)狀環(huán)狀質(zhì)粒7-107-1017-2035-4535-4770-10090-105100-300＜350100-2000？-10000300pBR322,pUC18，pBluescriptλgt10，λgt11，

pBAC108LpYAC2

pYLTAC17(23kb)西南大學西南大學

酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）、

細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）、

噬菌體P1克隆系統(tǒng)（P1clone）、由P1衍生的PAC載體(P1-derivedartificialchromosome,PAC

以大腸桿菌小F因子為基礎的載體（miniF-basedplasmid）

具有F因子和粘粒特征的Fosmid。

哺乳動物基因克隆用的哺乳動物人工染色體（mammalianartificialchromosome,簡稱MAC）

新型克隆載體—可轉(zhuǎn)化人工染色體(Transformation-competentArtificialChromosome)西南大學西南大學質(zhì)粒（plasmid）噬菌體(

phage）BAC載體(BACvector)

常用的載體（phagemid）西南大學西南大學是存在于天然細菌細菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA，具有獨立復制的能力，通常帶有細菌的抗藥基因。1．質(zhì)粒Ori,復制起點，colE1MCS西南大學西南大學

最早的克隆載體是Cohen等（1973）構(gòu)建的質(zhì)粒（plasmid）pSC101。第一個比較理想的克隆載體pBR322。該質(zhì)粒分子大小為4.3kb，帶有抗四環(huán)素和抗氨芐青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等單一的限制酶切點。隨后克隆載體的整體結(jié)構(gòu)和克隆效率已有很大改善。

西南大學西南大學

pBR3224363bps1000200030004000ClaIHindIIIEcoRVNheIBamHISgrAISphIEcoNISalIPshAIXmaIIINruIBspMIBsmIStyIAvaIBalIBsgIPvuIIINdeISapIIIAflNIAlwIBsaIAseIPstIPvuIScaISspIIAatRIEcoTetoriAp西南大學西南大學

pUC182686bps5001000150020002500ApoIEcoRISacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaIHincIISalIPstISphIHindIIIEheINarINdeIAatIISspIXmnIScaIIGsuIBsaIIIAflISaplacApColE1pUC系列Uni.OfCaliforniapUC1……pUC18pUC19……pUC57西南大學西南大學質(zhì)粒pUC19的分子結(jié)構(gòu)西南大學西南大學

pGEM-3Zf+3197bps50010001500200025003000EcoRISacIKpnISmaIBamHIXbaISalIPstISphIHindIIISapIAflIIIAlwNIEam1105BsaIIGsuIScaIIIDraAIBsaINaeMINgolacZAmpf1pGEM系列pGEM-3Zf±……pGEM-7Zf±……pGEM-11Zf±pGEM-13Zf(±)西南大學西南大學pBlueScriptIIKS+pBlueScript系列pBlueScriptIKS+pBlueScriptIKS-pBlueScriptISK+pBlueScriptISK-pBlueScriptIIKS+pBlueScriptIIKS-pBlueScriptIISK+pBlueScriptIISK-西南大學西南大學pYES25857bps10002000300040005000HindIIIKpnISacIBamHIEcoRINotIXhoISphIXbaIBglIIApaINheIClaBISnaP-GAL1CYC1TTpUCoriApURA32uorif1ori酵母克隆和表達載體西南大學西南大學西南大學西南大學T-載體.pGEM-TEasyvectorpUCm-TpCRⅡ-TOPOpMD18-T西南大學西南大學.

PstI27741Bg1IICTGCAGACCAGGTCTAGACTGGAGATCTGACGTCTGGTCCAGTTCTGACCTCTAGA西南大學西南大學T-載體.西南大學西南大學Features由pUC18改進。

EcoRV處構(gòu)成gatT

ATCG

CTATtagC

.-T西南大學西南大學B-載體pUCm-B載體(自殺式平端克隆載體)

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2.噬菌體

phage（WT）:20min,100個改造的

phage:gt10,gt11ZAPTriplEx2(Lox/Cre)

DNA,50kb,20kb可切除12ntCos序列西南大學西南大學可通過轉(zhuǎn)染方式將其DNA送入細菌體內(nèi)進行增殖。常用的為人工構(gòu)建的λ噬菌體載體。噬菌體兩端的片段對于其包裝是必需的，因而應予保留；而其中間部分則可進行改造或置換，使之具有某種單一的限制酶切點。目的基因與噬菌體DNA進行重組時，可采用插入重組方式，也可采用置換重組方式。

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M13phage20min,100個Copy:100-200絲狀phage,

6500nt的單鏈閉環(huán)DNA,

只吸附到E.coli的F傘毛上，只侵染F或Hfr大腸桿菌，只有507nt

為基因間隔區(qū)，為非必需區(qū)，可裝載300-400bp,>1000bp

不穩(wěn)定不對稱復制包被M13f1WTM13phagessDNA開鏈進入E.colidsDNA大量復制dsDNA合成外殼蛋白西南大學西南大學哺乳動物常用猴SV40病毒載體，通過感染方式將其DNA送入哺乳動物細胞中進行增殖。植物已開發(fā)出煙草脆裂病毒(TRV)和大麥條紋花葉病毒(BSMV)的表達載體，

（如用于VIGS(Virus-inducedgenesilencing)）3．病毒：西南大學西南大學基因克隆載體

載體結(jié)構(gòu)插入(kb）代表載體PlasmidPhagemidBacteriophageFosmidCosmidP1cloneMiniF-basedPlasmidPACBACYACMACBiBAC質(zhì)粒

噬菌體

粘粒

P1衍生的人工染色體細菌人工染色體酵母人工染色體哺乳動物人工染色體雙元細菌人工染色體環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒線狀DNA環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒線狀DNA環(huán)狀環(huán)狀質(zhì)粒7-107-1017-2035-4535-4770-10090-105100-300＜350100-2000？-10000300pBR322,pUC18，pBluescriptλgt10，λgt11，

pBAC108LpYAC2

pYLTAC17(23kb)西南大學西南大學§3常用的宿主細菌K12TOPO1、……、TOPO10JM101、……、JM109DH5、……、DH10XL1-Blue（染色體帶Tn10，具Tet抗性）Escherichia

coliHoststrainsBM25.8西南大學西南大學GenotypeofXL1-Blue

endA1,gyrA96,hsdR17,lac–,recA1,relA1,

supE44,thi-1,[F'lacIqZDM15,proAB,Tn10]Note:Tn10confersresistancetotetracycline.Reference:Woodetal.,1985Stock/plate:LB/tet(15mg/ml)Application:-Libraryplating&screening-Blue/white(b-galactosidase)screening-Regulatedexpressionofclonedgenes西南大學西南大學GenotypeofBM25.8

supE44,thiD(lac–proAB)[F’traD36,proAB+,lacIqZDM15],imm434(kanR)P1(camR)hsdR(rk12–mk12–)Note:BM25.8islysogenicforphageslandP1andisusedforautomaticsubcloning.Reference:Palazzoloetal.,1990Stock/plate:LB/kan(50mg/ml)/cam(34mg/ml)Application:Cre-lox-mediatedexcisionofpTriplEx2fromlTriplEx2西南大學西南大學E.colistrain的保存方法保存方法有效時間1LB平板，4℃貯存1-3個月2LB固體培養(yǎng)基，穿刺密封，4℃貯存2年345%甘油，密封，4℃貯存長期保存？415%～20%甘油，-40℃～-86℃低溫冰箱貯存長期保存5真空干燥牛奶管，4℃貯存長期保存（>10年？）Note:保存時間受很多因素影響，因此要定期檢查，多份保存。西南大學西南大學§4原核細胞的轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定一、DNA重組技術(shù)選用適當?shù)腞E，分別對載體DNA和目的基因進行剪切，以便于重組。由限制酶切斷后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三種情況。形成粘性末端(cohesiveend)者較有利于載體DNA和目的基因的重組。

1.載體和目的基因的剪切西南大學西南大學2.載體和目的基因的連接粘端連接平端連接加接頭后連接

同聚尾連接即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的DNA分子。

Taq

DNA聚合酶加“A”尾后與T載體進行TA克隆西南大學西南大學（1）粘性末端連接法：當載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進行切斷時，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進行互補粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。西南大學西南大學載體DNA與目的基因的連接西南大學西南大學（2）平端連接法：用T4連接酶加PEG(聚乙二醇)提高連接效率，但要防止外源DNA片段串聯(lián)插入插入的方向隨機效率通常不高西南大學西南大學（3）人工接尾法：即同聚物加尾連接法(同聚尾連接)。當載體和目的基因無法采用同一種限制酶進行切斷，無法得到相同得粘性末端時，可采用此方法。此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3'-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過堿基互補進行粘合，再由DNA連接酶連接。

RERE末端轉(zhuǎn)移酶dCTPdGTPCCCCGGGGGG西南大學西南大學將人工接頭（即一段含有多種限制酶切點的DNA片段）連接到載體和目的基因上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進行切斷，得到可以互補的粘性末端。

（4）人工接頭連接法：A.銜接體（Linker）B.接合體（Adaptor）西南大學西南大學A.銜接體（Linker）：人工合成的雙鏈DNA短片段，8-12bp,平端分子，包含一個粘性末端的RE位點。BamHIlinker(10mer):CGGGATCCCGGCCCTAGGGCCGGGCCCTAGGGATCCCGGGCEcoRIlinker(12mer):CCGGAATTCCGGGGCCTTAAGGCC西南大學西南大學銜接體（Linker)的應用平端分子dam甲基化酶-GATC--GATC-CH3甲基化酶CH3CH3CH3CH3T4DNALigaseRE酶切CH3CH3粘端分子西南大學西南大學HOPOHOHB.接合體（Adaptor）：人工合成的雙鏈DNA短片段，非平端分子，一端為平端，另一端為粘端。粘端是RE切開的殘基粘端的5’端去磷酸化，以防接頭自連接。EcoRIAdaptor:AATTCCGTTGCTGTCGGGCAACGACAGCHOOHPO32-HO5’5’3’3’PHOOHOH西南大學西南大學接合體（Adaptor)的應用T4DNALigase平端分子PPOHHO多核苷酸激酶kinaseATPPHOOHHOPHOOHHOHOPOHOH粘端分子OHOHHOHOPOHHOPOHOHHOHO西南大學西南大學3.轉(zhuǎn)化重組DNA需導入宿主細胞才能進行增殖或表達。重組質(zhì)?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)化（transformation）方式導入宿主細胞。把純化的DNA導入細菌細胞的過程叫做轉(zhuǎn)化，即將大腸桿菌用CaCl2處理，增加細菌細胞壁的通透性，再與重組質(zhì)粒DNA短暫溫育，質(zhì)粒DNA即可導入宿主細胞。

可以接受DNA的細胞稱為感受態(tài)細胞（competentcalls）。西南大學西南大學常用缺少RE酶基因的細菌，即重組缺陷型（RecA-）菌株，避免外源DNA不被降解和發(fā)生同源重組。電穿孔法（Electroporation）熱激法一步法（2xTSS）西南大學西南大學如果是用λ噬菌體作為載體的重組體，則需要用外殼蛋白進行包裝，使之成為具有感染能力的噬菌體，再通過轉(zhuǎn)染(t