基因工程的基本操作程序課件

基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴增3、人工合成基因組文庫:基因文庫中包含了一種生物所有的基因，這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫:基因文庫中包含了一種生物的一部分基因，這種基因文庫叫做部分基因文庫.基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系①基因組文庫的構(gòu)建（2）基因文庫的構(gòu)建方法通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因基因組DNA限制酶基因重組轉(zhuǎn)化細菌體外包裝②cDNA文庫的構(gòu)建-----反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫這種生物的cDNA文庫基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性④從基因文庫中得到目的基因的方法2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——聚合酶鏈式反應(yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。PCR技術(shù)原理：前提：原料PCR擴增儀DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）

過程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合延伸：加熱至70～75℃以目的基因為模板，在Taq酶的作用下合成互補的新DNA鏈變性退火延伸（3）人工合成—化學(xué)合成法——根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA

蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成1、在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG／TACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進行人工復(fù)制，復(fù)制時應(yīng)給予的條件是①雙鏈DNA分子為模板②ATGTG或TACAC模板鏈③四種脫氧核苷酸④四種核苷酸⑤DNA聚合酶⑥熱穩(wěn)定DNA聚合酶⑦引物⑧溫度變化⑨恒溫A．①③④⑦⑨B．①④⑥⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑨D．①③⑥⑦⑧D1、在已知序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是A、化學(xué)合成法

B、基因組文庫法C、cDNA文庫法

D、聚合酶鏈反應(yīng)2、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是①從基因文庫中獲取目的基因②利用PCR技術(shù)擴增目的基因③反轉(zhuǎn)錄法④通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③AD1）以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是A、能復(fù)制（）B、有多個限制酶切點C、具有標記基因D、它是環(huán)狀DNAD4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時才用B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運載體D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D5）基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是（）A、人工合成目的基因B、目的基因與運載體結(jié)合C、將目的基因?qū)胧荏w細胞D、目的基因的檢測和表達C3、人工合成法：基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成1、原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄1、原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子RNA聚合酶:能夠識別啟動子上結(jié)合位點的一種蛋白質(zhì).RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列.包括啟動子和終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子2、真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點（啟動子）。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的3、原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼二、基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心1、目的：所需物質(zhì)：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。它們各自的作用是什么?2、基因表達載體的組成：復(fù)制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因它們各自的作用是什么?啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。thunder://QUFodHRwOi8veGxpc3N1ZTExMC5zYW5kYWkubmV0L+WImOWYieeOsi5yYXI/ZmlkPXdCOGYtZXdiVTZLVFRrNjRPUVlQdDJsQnNLVURicmdSQUFBQUFKbWU5QUp3dU1UQVpQTypEKkZ0emxad2Y1TUEmbWlkPTY2NiZ0aHJlc2hvbGQ9MTUwJnRpZD0wRDdGMzQ4NjY1QTU0MDMxNUEzNjlFRDBBQUJEMDhDRCZzcmNpZD0xMTImdmVybm89MVpa注意三將目的基因?qū)胧荏w細胞（一）轉(zhuǎn)化：（二）方法將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達1、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ海?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。③過程：④優(yōu)點（2）基因槍法（3）花粉管通道法2、將目的基因?qū)雱游锛毎俜椒ǎ猴@微注射法②程序：目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎僭松锾攸c：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少②方法：

用Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子四、目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功（一）、檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:歸納步驟DNA分子雜交示意圖采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P15思考與探究（二）、鑒定（個體生物學(xué)水平）2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA歸納步驟歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和

法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用

技術(shù)，該技術(shù)的核心是

和

。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的

作探針進行分子雜交檢測，又要用

方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。答案：（1）aa（2）基因槍法（花粉管通道法）（3）植物組織培養(yǎng)（1分）脫分化（去分化）再分化（4）耐鹽基因（目的基因）一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）1）以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C練習(xí)2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是A、能復(fù)制（）B、有多個限制酶切點C、具有標記基因D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A練習(xí)4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時才用B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運載體D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D練習(xí)5）基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是（）A、人工合成目的基因B、目的基因與運載體結(jié)合C、將目的基因?qū)胧荏w細胞D、目的基因的檢測和表達C練習(xí)(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定——①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交逆轉(zhuǎn)錄法目的基因的mRNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成逆轉(zhuǎn)錄2.基因文庫的構(gòu)建方法②人工合成法（真核生物）推測推測單鏈DNA合成①基因組文庫的構(gòu)建（2）基因文庫的構(gòu)建方法通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因②cDNA文庫的構(gòu)建-----反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下