DB37T 3317-2018雞白血病多重PCR和斑點雜交檢測方法

ICS65.020.30B45DB37Laboratorydetectiontechnologiesofmulti-PCRanddothybridationfordiagnosisof山東省質量技術監(jiān)督局發(fā)布前本標準按照GB/T1.1給出的規(guī)則起草。本標準由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標準由山東省畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。本標準主要起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學。本標準規(guī)定了我省針對禽白血病的診斷檢測技術的方法。本標準適用于企、事業(yè)單位禽病診斷實驗ALV-A/B和ALV-J的檢測,判斷雞群是否患A/B、J亞群白血2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T26436禽白血病診斷技術NY/T680禽白血病病毒p27抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1禽白血病AvianLeukosis，AL反轉錄病毒科甲型反轉錄病毒屬禽反轉錄病毒引起的以禽類造血組織中某些細胞成分過度增生為主的可傳染的腫瘤性疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為嗜睡、食欲不振、雞體消瘦、雞冠和肉髯呈淡紫色，腹部顯著增大，胸骨異常隆起。根據(jù)病毒囊膜蛋白的抗原性差異、病毒干擾實驗、宿主范圍等生物學特性，將禽白血病肉瘤病毒群分成A-J共10個亞群，其中A、B、C、D、E和J亞群的宿主是雞，流行于我國禽群的主要是A、B和J亞群。ALV-J的危害最為嚴重，目前在雞群中平均感染率為10%左右，呈現(xiàn)間歇性爆發(fā)；ALV-A/B零星爆發(fā)，平均感染率在1%左右。J亞群主要誘發(fā)髓細胞性白血病，而A/B亞群主要造成淋巴細胞性白血病和肉瘤。禽白血病自發(fā)現(xiàn)以來，發(fā)病率不斷呈上升趨勢，在世界各地均有發(fā)生，呈世界性分布，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一。3.2多重PCR技術Multiplepolymerasechainreaction，M-PCR在普通PCR的基礎上加以改進,于一個PCR反應體系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴增多個目的片段的PCR技術。3.3斑點分子雜交技術dotblotting是直接從待檢雞只的組織或血液樣品提取DNA,將變性的DNA樣品點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后與制備的特異性探針進行雜交來檢測樣品中的前病毒DNA。4試劑或材料除另有規(guī)定外，所有化學試劑均為分析純。4.1常規(guī)使用的商品化的DNA提取試劑盒。4.2常規(guī)使用的商品化的RNA提取試劑盒。4.3LB培養(yǎng)基所需胰蛋白胨（Rryptone）、酵母抽提物（YeastExtract）試劑。4.4MultiHotstartDNAPolymerase(5U/μL)、10×MultiHotstartBuffer(+Mg2+)、Mgcl2（25Mm）、SuperPuredNTP(2.5Mmeach)、PCR瓊脂糖凝膠回收試劑盒、RNAprepPure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒。4.5DL1000DNAMarker、PMD18-T載體、6×loadingBuffer、PrimeScriptTMRTMasterMix。4.6禽白血病抗原檢測試劑盒。4.7斑點雜交所需溶液。4.7.11M馬來酸：見附錄A中A.1。4.7.2洗滌緩沖液(馬來酸緩沖液)：見附錄A中A.2。4.7.3顯色緩沖液：見附錄A中A.3。4.7.510%SDS（sodiumdodecylsulfate）溶液：見附錄A中A.5。4.7.620×SSC（salinesodiumcitrate）溶液：見附錄A中A.6。4.7.7封閉溶液（Blocking溶液）：見附錄A中A.7。4.7.9預雜交溶液：見附錄A中A.9。4.7.11NBT/BCIP顯色液：見附錄A中A.11。4.7.12探針標記和檢測試劑盒（使用Roche公司產(chǎn)品）。4.7.13制備探針所需特異性引物序列：見附錄B。4.7.14PT-PCR擴增條件見附錄C。5儀器設備5.1各量程移液槍，PCR儀，梯度PCR儀，紫外分光光度計。5.2高速臺式冷凍離心機。5.3紫外分析儀。5.4凝膠成像系統(tǒng)。5.5MK3型酶標儀。5.6恒溫搖床。5.7恒溫恒濕箱、立式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺。5.8雙穩(wěn)定時電泳儀、核酸電泳槽。5.9超聲波細胞粉碎機。5.10數(shù)顯超純水機。5.11全自動雪花制冰機5.12數(shù)顯恒溫水浴鍋。5.13電熱恒溫鼓風干燥箱。5.14HealForce二氧化碳培養(yǎng)箱。5.15pH計。5.16恒溫磁力攪拌器。5.17三洋超低溫保存箱。5.18高壓滅菌器。5.19硝酸纖維素膜或尼龍膜。5.20冰箱。6樣品采集6.1組織樣品該病主侵器官是肝、脾、腎，采集組織樣品時，主要變與健康交界處的組織。用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品裝入凍存管，編號，迅速放入液氮罐中或送實驗室-80℃冰箱備用。6.2樣品儲運室凍存?zhèn)溆谩?.3樣品存放樣本采集后迅速放入液氮罐中，若需長期保存應放在-80℃冰箱，但應避免反復凍融。7操作方法7.1方法概要7.1.1多重PCR基于ALV-A、ALV-J的保守性基因，合成了特異性引物（見附錄D），從混合病毒中，提取了混合病毒的RNA并逆轉錄為cDNA，運用多重RT-PCR技術擴增出545bp(ALV-J)、692bp(ALV-A)的特異性片段。7.1.1.1ALV-A、ALV-J的擴增將復蘇后的DF-1細胞進行傳代25cm2的培養(yǎng)瓶，4h后取保存于-80℃的病毒液，經(jīng)0.22μm濾器d，7d后收集細胞上清即為擴增的病毒液。7.1.1.2接毒培養(yǎng)細胞總RNA的提取培養(yǎng)7d后的細胞吸棄上清后，按照1mL每瓶（以覆蓋細胞瓶底壁為參考）25%胰酶進行消化30s，倒棄胰酶后加入PBS5mL清洗細胞，移入離心管后按照1006.2×g離心2min。將分離的細胞用商品化試劑盒提取RNA，并反轉錄成cDNA，保存于-80℃超低溫冰箱中。7.1.1.3總RNA的逆轉錄反應先去除RNA中的DNA：5×gDNAEraserBuffer2μL，gDNAEraser1μL，總RNA1μg,加無RNAse雙蒸水至10μL，42℃2min；然后進行RNA的逆轉錄：在以上的液體中加5×PrimeScriptTMRTMasterMix2μL,加無RNAse雙蒸水至20μL，混勻后，37℃反應15min，85℃5S，然后置于4℃。7.1.1.4多重RT-PCT體系見附錄E。7.1.1.5PCR反應后以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析7.1.2斑點雜交準備好自制的特異性探針，提取樣品DNA，將變性的DNA樣品點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后與制備的特異性探針進行雜交，通過觀察出現(xiàn)的斑點來檢測樣品中的前病毒DNA。7.1.2.1樣品DNA的制備按照DNA提取試劑盒說明書的方法，提取DNA，并于4℃保存?zhèn)溆谩?.1.2.2探針目的基因設計與合成用DNAStar軟件設計通用探針和各亞群探針的目的基因，送生物技術有限公司合成ALVp27部分基因和ALV-Jenv部分基因作為探針目的基因。7.1.2.3核酸探針標記a)按照地高辛標記試劑盒的說明書對上述回收的通用探針基因片斷和各亞群探針基因片段進行標記。在Eppenderf管中，加1μgDNA模板，高壓滅菌雙蒸水至16μL；b)沸騰水浴變性10min，迅速冰浴2min,充分變性有利于標記；c)將混合地高辛引物4μL，至變性的DNA中，離心313×g；d)孵化37℃,24h，時間延長會增加標記產(chǎn)物；e)加2μL0.2MEDTA(pH=0.8)終止反應。7.1.2.4探針標記效率的檢測a)分別從2～9管（標記探針）和標記陰性探針對照中取1μL到尼龍膜；b)固定核酸到膜上（烤箱120℃,30minc)把尼龍膜轉移到20mL馬來酸緩沖液里面，搖晃2min；d)10mL封閉液孵育30min；e)10mL一抗孵育30min；f)10mL洗滌液沖洗15min×2次；g)10mL稀釋液平衡2min～5min，調節(jié)pH=9.5；h)2mL底物顯色液黑暗中孵育；i)50mL滅菌雙蒸水沖洗尼龍膜，終止反應。7.1.2.5斑點雜交檢測a)剪取適合大小的尼龍膜0.7mm×0.7mm，劃好格子，做好標記；b)膜上做好標記，分別吸取1.0μL樣品DNA點于膜上格子中央；c)將硝酸纖維素膜（NC膜，點樣面朝上）放于已用變性液飽和的雙層濾紙上變性10min；d)再放于已用中和液飽和的雙層濾紙上中和5min；e)NC膜室溫干燥30min，然后在80℃干烤2h固定DNA；f)將NC膜放于預雜交液于68℃反應2h，期間經(jīng)常搖動NC膜；g)將探針于沸水中變性10min，取出立即置于冰水浴中5min；將變性的探針倒入預雜交液中，充分混勻即成雜交液，使NC膜在其中68℃雜交6h以上（一般雜交過夜）；將膜取出放于h)將NC膜放于洗液Ⅰ中于室溫洗滌15min，2次，期間經(jīng)常搖動NC膜；洗液Ⅱ中于68℃洗滌15min，2次，期間經(jīng)常搖動NC膜；緩沖液Ⅰ中洗1min；緩沖液Ⅱ中反應30min，期間經(jīng)i)在20ml緩沖液Ⅱ中加入4μL抗Digoxiaenin抗體（堿性磷酸酶標記物，用之前離心5min，7826g，將膜放于其中37℃浸泡30min；洗膜：緩沖液Ⅰ洗滌；5min×5次；j)緩沖液Ⅲ中反應浸泡2min；在適當大小的平皿中加入10mL緩沖液Ⅲ和100μL（NBT和BCIP混合物），將NC膜放入其中顯色30min～1h，注意顯色時應避光保存；加入TE緩沖液（pH=8.0）終止顯色反應。7.2結果判定7.2.1多重PCR結果分析條件設定7.2.1.1以ALV-A、ALV-J為陽性對照，凝膠電泳上陽性對照出現(xiàn)特異性目的條帶為檢測結果成立的前提條件，否則結果不成立。7.2.1.2凝膠電泳上未出現(xiàn)特異性目的條帶判定為陰性。7.2.1.3凝膠電泳上出現(xiàn)特異性目的條帶判定為陽性。7.2.2斑點雜交結果7.2.2.1以標準模式株ALV為陽性對照，SPF雞肝臟、禽網(wǎng)狀內皮組織增生癥病毒（REV）、馬立克氏病病毒（MDV）為陰性對照，陽性對照出現(xiàn)斑點和陰性對照不出現(xiàn)斑點為檢測結果成立的前提條件，否則結果不成立。7.2.2.2點樣膜上不出現(xiàn)斑點視為陰性。HYPER