基因芯片潘麗華

1.什么是基因芯片

生物芯片，將大量生物識別分子按預先設置的排列固定于一種載體（如硅片、玻片及高聚物載體等）表面，利用生物分子的特意性親和反應，如核酸雜交反應，抗原抗體反應等來分析各種生物分子存在的量的一種技術。基因芯片（genechip），又稱DNA微陣列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通過雜交檢測信息?，F(xiàn)在是1頁\一共有25頁\編輯于星期五五十年代DNA分子結構和半保留復制模型的建立六十年代基因編碼的確定七十年代限定性內切酶的發(fā)現(xiàn)和DNA重組技術的建立八十年代PCR的發(fā)明九十年代人類基因組計劃的實施2.基因芯片的誕生現(xiàn)在是2頁\一共有25頁\編輯于星期五生物科學正迅速地演變?yōu)橐婚T信息科學。我們正由結構基因組時代邁入功能基因組時代。隨著這個功能基因組學問題的提出（后基因組時代，蛋白組學），涌現(xiàn)出許多功能強大的研究方法和研究工具，最突出的就是細胞蛋白質二維凝膠電泳（2-D-gel）（及相應的質譜法測蛋白分子量）和基因芯片（Genechip）技術分子生物學的發(fā)展推動了基因的研究現(xiàn)在是3頁\一共有25頁\編輯于星期五美國繼開展人類基因組計劃以后，于1998年正式啟動基因芯片計劃，美國國立衛(wèi)生部、能源部、商業(yè)部、司法部、國防部、中央情報局等均參與了此項目。同時斯坦福大學、麻省理工學院及部分國立實驗室如ArgonneOakridge也參與了該項目的研究和開發(fā)。英國劍橋大學、歐亞公司正在從事該領域的研究。世界大型制藥公司尤其對基因芯片技術用于基因多態(tài)性、疾病相關性、基因藥物開發(fā)和合成或天然藥物篩選等領域感興趣，都已建立了或正在建立自己的芯片設備和技術。目前全世界有幾百家基因芯片公司，有多種生物芯片問世，而且這些芯片的特點較以前密度更高，檢測方法更精確，特異性更強的特點。而主要仍以少數(shù)幾家公司為主，如Affymetrix、Brax、Hysep等。國內目前主要如清華大學（程京）、中科院生命科學院、上海復旦大學、北京軍事醫(yī)學科學院、南京東南大學、西安等四十余家公司，而且可能還有一大批公司相繼成立?，F(xiàn)在是4頁\一共有25頁\編輯于星期五基因芯片是信息時代的產(chǎn)物生命科學、物理學、計算機科學、微電子技術光電技術、材料科學等現(xiàn)代高科技現(xiàn)在是5頁\一共有25頁\編輯于星期五3.基因芯片的分類根據(jù)探針的類型和長度，基因芯片可分為兩類。其中一類是較長的DNA探針（100mer）芯片這類芯片的探針往往是PCR的產(chǎn)物，通過點樣方法將探針固定在芯片上，主要用于RNA的表達分析。另一類是短的寡核苷酸探針芯片其探針長度為25mer左右，一般通過在片（原位）合成方法得到，這類芯片既可用于RNA的表達監(jiān)控，也可以用于核酸序列分析?，F(xiàn)在是6頁\一共有25頁\編輯于星期五元件型微陣列芯片生物電子芯片凝膠元件微陣列芯片藥物控釋芯片

通道型微陣列芯片毛細管電泳芯片PCR擴增芯片集成DNA分析芯片毛細管電層析芯片生物傳感芯片光學纖維陣列芯片白光干涉譜傳感芯片一般基因芯片按其材質和功能，基本可分為以下幾類現(xiàn)在是7頁\一共有25頁\編輯于星期五6400點的基因芯片（面積12X14mm)現(xiàn)在是8頁\一共有25頁\編輯于星期五核酸雜交技術是基因芯片應用的基礎。4.基因芯片的原理現(xiàn)在是9頁\一共有25頁\編輯于星期五基因芯片的基本原理任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個序列固定、錯落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5個8nt亞序列：現(xiàn)在是10頁\一共有25頁\編輯于星期五

原理--通過雜交檢測信息一組寡核苷酸探針—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC

ATACGTTA現(xiàn)在是11頁\一共有25頁\編輯于星期五現(xiàn)在是12頁\一共有25頁\編輯于星期五原位合成直接點樣原位光蝕刻合成原位噴印合成

分子印章法針式點樣噴墨點樣光導原位合成法

基因芯片的制作方式現(xiàn)在是13頁\一共有25頁\編輯于星期五1、原位光蝕刻合成寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術是由Affymetrix公司開發(fā)的，采用的技術原理是在合成堿基單體的5'羥基末端連上一個光敏保護基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護，然后一個5'端保護的核苷酸單體連接上去，這個過程反復進行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含n個核苷酸的寡聚核苷酸，通過4×n個化學步驟能合成出4n個可能結構。例如：一個完整的十核苷酸通過32個化學步驟，8個小時可能合成65,536個探針。現(xiàn)在是14頁\一共有25頁\編輯于星期五2、光導原位合成法現(xiàn)在是15頁\一共有25頁\編輯于星期五點樣法

點樣法是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。點樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。

采用人工點樣的方法將寡核苷酸分子點樣于化學處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過分區(qū)后用計算機控制的微陣列點樣機按照預先設計順序點上核酸分子，點樣量很小，約為5nl。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強的親和勢和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類PCR產(chǎn)物?，F(xiàn)在是16頁\一共有25頁\編輯于星期五現(xiàn)在是17頁\一共有25頁\編輯于星期五現(xiàn)在是18頁\一共有25頁\編輯于星期五基因芯片的應用1.基因功能分析研究2.檢測與疾病相關的基因,進而用于疾病診斷3.藥物篩選,4.檢測基因突變5.其他(環(huán)境化學毒物的篩選

\體質醫(yī)學的研究)現(xiàn)在是19頁\一共有25頁\編輯于星期五基因功能分析研究將成千上萬個我們克隆到的特異性靶基因固定在一塊芯片上，對來源于不同個體不同組織不同細胞周期不同發(fā)育階段不同分化階段不同病變不同刺激（包括不同誘導不同治療手段）下細胞內的mRNA或逆轉錄所得的cDNA進行檢測，從而對這些基因表達的個體特異性組織特異性發(fā)育階段特異性分化階段特異性。進行綜合評定與判斷，極大加快這些基因功能的確立。現(xiàn)在是20頁\一共有25頁\編輯于星期五檢測與疾病相關的基因,進而用于疾病診斷目前主要涉及：癌癥、心血管疾病、血液病、遺傳性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、部分感染性疾病、免疫反應相關性疾病毒物引起的損傷等?，F(xiàn)在是21頁\一共有25頁\編輯于星期五藥物篩選

在基因功能研究基礎上，特別是確立了與某些疾病相關基因的表達變化情況后，就可針對疾病發(fā)生機理進行藥物篩選工作。將這些基因特異性片段固定在芯片上，研究病變組織和正常組只在某些藥物刺激下這些基因表達的變化，可快速判斷藥物作用的效果，并進行高通量篩選（highthroughoutscreening），可使新藥開發(fā)獲得技術上的突破。EvanseandRellingScience,286(5439):487,Oct15,1999現(xiàn)在是22頁\一共有25頁\編輯于星期五基因芯片的發(fā)展方向進一步提高探針陣列的集成度，如有多家公司的芯片陣列的集成度已達1.0×105左右，這樣基因數(shù)量在1.0×105以下的生物體（大多數(shù)生物體）的基因表達情況只用一塊芯片即可包括。

提高檢測的靈敏度和特異性。如檢測系統(tǒng)的優(yōu)化組合和采用高靈敏度的熒光標志。多重檢測以提高特異性，減少假陽性。高自動化、方法趨于標準化、簡單化，成本降低。價格高昂是目前推廣應用的主要障礙之一，但隨著技術的革新，基因芯片的價格將會大大降低?，F(xiàn)在是23頁\一共有25頁\編輯于星期五高穩(wěn)定性。寡核苷酸探針、RNA均不穩(wěn)定，易受破壞。而肽核酸（PNA）有望取代普通RNA/DNA探針，可以確保探針的高穩(wěn)定性。研制新的應用芯片，如1999年美國環(huán)保局(EPA)組織專家研討會，討論了毒理學芯片的發(fā)展策略。近來多種新的生物芯片不斷問世，這是物理學