神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法及應(yīng)用

神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法及應(yīng)用第1頁/共30頁神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)的歷史神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)方法是由Harrison，于1907年首創(chuàng)的。由于該方法具有簡(jiǎn)化細(xì)胞生化環(huán)境、明確生長(zhǎng)條件、便于施加實(shí)驗(yàn)因素及容易獲得活體直接觀測(cè)結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，因而已成為研究神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的有效手段。九十余年來，這項(xiàng)技術(shù)已從組織塊（或植塊）培養(yǎng)（explantculture）發(fā)展到分離細(xì)胞培養(yǎng)(dissociatedcellculture)，并逐漸與多種現(xiàn)代技術(shù)結(jié)合起來，在神經(jīng)科學(xué)各領(lǐng)域發(fā)揮了重大作用。第2頁/共30頁

組織塊培養(yǎng)→分離細(xì)胞培養(yǎng)→甚至單一型細(xì)胞培養(yǎng)第3頁/共30頁神經(jīng)組織的植塊培養(yǎng)法懸滴培養(yǎng)方法單蓋玻方法雙蓋玻方法1925改良雙蓋玻方法培養(yǎng)物：CNS灰質(zhì)、白質(zhì)、外周神經(jīng)節(jié)或神經(jīng)小段↓↓突起非神經(jīng)元外伸第4頁/共30頁優(yōu)點(diǎn)

所需培養(yǎng)液量少，可反應(yīng)組織代謝中微量生化改變保留了植塊內(nèi)組織特征第5頁/共30頁不足

培養(yǎng)空間小，O2CO2供少培養(yǎng)空間濕度難以控制，水分會(huì)蒸發(fā)密封手續(xù)繁雜，不利更換培養(yǎng)液，難以觀察單個(gè)神經(jīng)元生長(zhǎng)。第6頁/共30頁神經(jīng)元的分離細(xì)胞培養(yǎng)方法1956年，Nakai首創(chuàng)了神經(jīng)組織的分離培養(yǎng)方法材料來源：胚胎動(dòng)物神經(jīng)組織神經(jīng)元增殖發(fā)生于胚胎期形態(tài)學(xué)分化和化學(xué)分化程度低，體外存活強(qiáng)，成熟后則相反，且神經(jīng)元會(huì)受到大的普遍損傷。部位：灰質(zhì)、PNS神經(jīng)節(jié)，神經(jīng)元集中，密度大第7頁/共30頁神經(jīng)元的體外培養(yǎng)液

天然合成成分血清血漿胚胎撮液人工培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基化學(xué)限定性培養(yǎng)基常用的：DMEM+添加劑

F12第8頁/共30頁①葡萄糖為神經(jīng)元能量代謝主要來源33mm②CO2NaHCO3緩沖系統(tǒng)重要HEPESO2耗量更高③K+

神經(jīng)元生理活動(dòng)的重要離子，K+是神經(jīng)元存活所必需的，K+24.5mM能提高神經(jīng)元存活，促分化④非神經(jīng)元成分的抑制有2-3天第9頁/共30頁神經(jīng)元無血清限定培養(yǎng)液

人工合成的培養(yǎng)基雖然具備了細(xì)胞生長(zhǎng)的基本營養(yǎng)物質(zhì)和無機(jī)鹽類，但仍無法滿足不同類型細(xì)胞的特殊需要。大多數(shù)神經(jīng)元在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中即使能夠存活也為期不長(zhǎng)，更難以分裂。因此可根據(jù)神經(jīng)元的特性，給基礎(chǔ)培養(yǎng)中再添加某些特殊物質(zhì)。第10頁/共30頁選擇添加劑的基本過程

限定連續(xù)細(xì)胞系的體外生長(zhǎng)條件。試定該細(xì)胞系來源的細(xì)胞的培養(yǎng)液條件。第11頁/共30頁Bottenstein實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)如下添加劑比較好

人轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛胰島素、硒酸鈉、孕酮、腐胺加入到F12與DMEM1:1混液中，可以代替血清添加物，用來培養(yǎng)大鼠CNS的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞。刪去其中任何一種添加物都可導(dǎo)致成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀況銳減。該實(shí)驗(yàn)室共列出了三種神經(jīng)元限定性培養(yǎng)添加物的配方，代號(hào)分別為N1、N2、N3。第12頁/共30頁N1的配方為胰島素5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白5μg/ml孕酮20nM腐胺100Um硒30nM第13頁/共30頁神經(jīng)體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)基質(zhì)

膠元多聚賴氨酸

LN第14頁/共30頁神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)操作程序表

脊髓后根節(jié)大腦皮質(zhì)孕18~20天大鼠胚胎新生1~3天大鼠

在CMF-Hanks液中取出組織除去腦膜

與CMF-Hanks液一起移至離心管舍棄CMF-Hanks液，再加入5ml0.25%胰蛋白酶和5滴0.2%Dnase液第15頁/共30頁370C，30min舍棄胰蛋白酶，加入5ml培養(yǎng)液和10滴Dnase液用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加樣器頭的加樣器吹打20次若有組織殘?jiān)?，將上清移至新試管再?ml培養(yǎng)液反復(fù)吹打?qū)⒓?xì)胞懸液收集于離心管，離心1200r/min，8min，舍去上清，向沉淀加培養(yǎng)液，離心1200r/min，8min第16頁/共30頁加入培養(yǎng)液調(diào)整懸液中的細(xì)胞濃度，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞為1×107種入涂有poly-D-lysine的蓋片上，每片50μl放入CO2孵箱中過夜次日加3ml培養(yǎng)液2天后（培養(yǎng)的第三天）換入有DNA合成陰斷劑的培養(yǎng)液第17頁/共30頁神經(jīng)元的分離培養(yǎng)過程大鼠大腦皮層神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)組織來源新生大鼠1-2日齡，碘酒，灑精消毒。斷頭，取出大腦，分離腦膜，夾取兩側(cè)大腦皮質(zhì)放入接種培養(yǎng)液中，用D-Hank’s沖洗二遍。剪碎，0.5-1mm3,用D-Hank’s充分洗去殘血加入5-10倍量0.25%胰蛋白酶，移入離心管中放到水370C浴箱中消化20-25分鐘。終止消化離心洗滌2000轉(zhuǎn)/分，5分鐘棄上清。吹打制成細(xì)胞懸液。臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)后接種于事先涂好鼠尾膠的24孔板中。370C5%CO2培養(yǎng)2天后換生長(zhǎng)培養(yǎng)液第18頁/共30頁大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)方法

神經(jīng)元體外生長(zhǎng)特征接種密度與體外存活率

當(dāng)96孔每孔2000-3000個(gè)或7000-10000個(gè)/cm2幾乎無神經(jīng)元存活

當(dāng)8000-12000個(gè)/96孔或2.8萬-4萬個(gè)/cm2

存活率最大。3天后不到接種的一半，故研究某一生長(zhǎng)因子前3天加藥最好第19頁/共30頁神經(jīng)元的體外存活時(shí)間

短1-2W

長(zhǎng)4個(gè)月第20頁/共30頁體外分化標(biāo)志破傷風(fēng)毒素

NSENF200,NF160第21頁/共30頁神經(jīng)細(xì)胞的特殊染色鑒定方法

尼氏體染色

焦油紫

甲苯胺藍(lán)硫瑾等組化染色鍍銀染色

NADPH-d特異性神經(jīng)組織化學(xué)法第22頁/共30頁神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域研究各種因素對(duì)神經(jīng)的影響1.化學(xué)物質(zhì)，物理因素，生物因素，環(huán)境中化學(xué)因子，自由基，外傷、高溫等因素，病毒感染。2.藥物，細(xì)胞因子，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用，各種藥物，如中藥，腦活素，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），神經(jīng)營養(yǎng)因子3.細(xì)胞間相互作用：巨噬細(xì)胞，雪旺細(xì)胞等。4.各種生理病理狀態(tài)下神經(jīng)元狀態(tài)改變第23頁/共30頁實(shí)驗(yàn)方法研究手段及測(cè)量指標(biāo)1.形態(tài)學(xué)觀察：光鏡，相差顯微鏡：細(xì)胞數(shù)目，形態(tài)，大體結(jié)構(gòu)，突觸電鏡：超微結(jié)構(gòu)。2.激光共聚焦掃描顯微鏡（laserconfocalscanningmicroscope,LCSM)：研究細(xì)胞內(nèi)成分變化，離子改變等，三維重建3.膜片鉗技術(shù)，細(xì)胞表面通道和離子流動(dòng)，電變化。第24頁/共30頁研究手段及測(cè)量指標(biāo)4.聚丙烯酰胺凝膠電泳：細(xì)胞內(nèi)蛋白，核酸變化5.染色：蘇木素-伊紅（HE）染色及尼氏（Nissl)染色，免疫組化染色。6.顯微測(cè)量：胞體平均直徑和胞體橢圓率，突起長(zhǎng)度及胞徑。7.熒光光度分析儀：MTT法測(cè)定細(xì)胞的OD值第25頁/共30頁培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的觀察和鑒定1.神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)存活的標(biāo)志：種植24小時(shí)后貼壁，漸長(zhǎng)出幾十微米的突起，神經(jīng)細(xì)胞大多都能存活。2.特殊培養(yǎng)階段：培養(yǎng)的9到12天之間，有較多神經(jīng)元死亡，以后存活下的細(xì)胞突起長(zhǎng)而多，互相形成網(wǎng)絡(luò)，電鏡下可見突觸。3.形態(tài)學(xué)觀察：神經(jīng)細(xì)胞胞體大，飽滿，核大，