HLJ1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及生物學(xué)意義

第一章前言

肝細(xì)胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康、臨床上最常見的惡性腫瘤之一，具有高度的侵襲轉(zhuǎn)移性，易發(fā)生肝內(nèi)外的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后惡劣。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年的新發(fā)病例30-100萬(wàn)，死亡病例與發(fā)病病例之比幾乎達(dá)1：1[1]，而我國(guó)的肝細(xì)胞癌死亡率列全球首位[2]。經(jīng)數(shù)十年不懈努力，肝癌臨床研究取得了許多重大進(jìn)展，部分肝癌病人因早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療及綜合治療而獲得較長(zhǎng)期生存，但大部分病人確診時(shí)已屬中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)；而即使獲得手術(shù)切除機(jī)會(huì)的患者其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率也相當(dāng)高，加上肝癌本身對(duì)放療、化療的敏感性甚差，迫切需要研究和發(fā)展新的診療方法[3]。

現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)分子水平的研究成為近年研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，進(jìn)一步研究肝癌轉(zhuǎn)移的基因改變、尋找新的肝癌異常表達(dá)或缺失基因發(fā)生，從基因水平認(rèn)識(shí)肝細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，從而為早期診斷治療肝癌，判斷預(yù)后，實(shí)行針對(duì)患者個(gè)體生物學(xué)特點(diǎn)的治療提供新的方法?，F(xiàn)在是2頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一

熱休克蛋白（Heatshockprotein，Hsp）是廣泛存在于生物界中具有高度保守性質(zhì)的蛋白質(zhì)，在應(yīng)激狀態(tài)下可以被誘導(dǎo)表達(dá)[4]，根據(jù)同源程度及分子量大小可分為Hsp110、Hsp90、Hsp70和Hsp60、Hsp40、小分子Hsp(22～23kD)以及泛素等幾個(gè)家族。熱休克蛋白家族在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、基因轉(zhuǎn)錄等功能方面發(fā)揮重要的作用，其主要的生物學(xué)功能是在應(yīng)激狀態(tài)下保護(hù)細(xì)胞生命活動(dòng)必需的蛋白質(zhì)。熱休克蛋白與不同功能的多種蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，并通過(guò)其結(jié)合和解離參與靶蛋白的折疊、亞基間裝配、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸及降解，以調(diào)節(jié)靶蛋白的活性和功能，故熱休克蛋白又被稱作“分子伴侶”(molecularchaperone)[5-8]。近年發(fā)現(xiàn)HSP與腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)行為及其預(yù)后有較密切的關(guān)系[9]?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一HLJ1是最新發(fā)現(xiàn)的Dnaj類Hsp40家族成員之一，定位于人類染色體1P31.1，HLJ1蛋白由337個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子量約40kDa，屬于Hsp40家族[10]。HLJ1基因內(nèi)含有一個(gè)能驅(qū)動(dòng)其轉(zhuǎn)錄活性的區(qū)域，序列分析顯示此區(qū)缺失TATA盒，存在一個(gè)CCAAT盒，并有四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子YY1（Yin-Yang-1，又稱NF-E1）的結(jié)合位點(diǎn)，這對(duì)調(diào)控HLJ1的表達(dá)是非常重要的[11]?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一最新的研究證實(shí)，HLJ1參與了STAT1和P21WAF1信號(hào)路徑，能夠上調(diào)STAT1、P21WAF1的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)CyclinD1的表達(dá)[12]。P21WAF1的表達(dá)上調(diào)和CyclinD1的表達(dá)下調(diào)能夠減緩細(xì)胞分裂和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[13-17]。此外，HLJ1能上調(diào)鈣粘蛋白E的表達(dá)并能抑制CD44的表達(dá)，從而降低細(xì)胞的侵襲力[18-19]。Chen等進(jìn)行了篩選腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的實(shí)驗(yàn)，用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了一個(gè)肺癌侵襲性細(xì)胞系模型，發(fā)現(xiàn)HLJ1跟腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)?，F(xiàn)在是5頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一HLJ1是一個(gè)新的抑癌基因，具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲、遷移，促進(jìn)凋亡、參與細(xì)胞周期調(diào)控等作用，并與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)HLJ1在肝細(xì)胞癌中表達(dá)情況，HLJ1與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系等研究尚未見報(bào)道。因而，本課題將研究HLJ1在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及其與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系?，F(xiàn)在是6頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一第二章材料和方法2.1材料2.1.1標(biāo)本收集及臨床病理資料組織標(biāo)本取自2005年3月至2006年12月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院外科手術(shù)切除的32例肝細(xì)胞癌組織和32例相對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距腫瘤邊緣≥2cm），標(biāo)本離體后迅速取材，一部分置入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-70℃超低溫冰箱存放。在取材時(shí)務(wù)必注意避開壞死組織，全部病例均未接受包括肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)等在內(nèi)的多種腫瘤治療。現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一32例HCC中男性27例，女性5例，年齡27~62歲，中位年齡41歲；其中合并肝硬化的20例（62.5％），無(wú)肝硬化的12例（37.5％）；直徑大于5cm的共21例（65.6％），小于或等于5cm的共11例（34.4％）；有靜脈浸潤(rùn)的16例（50.0％），無(wú)靜脈浸潤(rùn)的16例（50.0％）；單結(jié)節(jié)的21例（65.6％），多結(jié)節(jié)的11例（34.4％）；Edmonson分級(jí)Ⅰ－Ⅱ級(jí)的12例（37.5％），Ⅲ－Ⅳ級(jí)的20例（62.5％）。所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)診斷。現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一2.1.2主要試劑TRIZOL晶美生物科技公司RT-PCR試劑盒（DR019A）大連寶生物公司2.1.3引物所有引物均由上海英俊公司負(fù)責(zé)合成2.1.4主要儀器移液槍 Eppendorf低溫高速離心機(jī) EppendorfPCR儀 PerkinElmerDNA凝膠電泳設(shè)備 BioRad凝膠電泳成像分析儀BioRad現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一2.2方法2.2.1實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線組織標(biāo)本（32對(duì)）提取組織總RNART-PCR臨床病理資料分析結(jié)果得出結(jié)論相關(guān)性分析現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一2.2.2RT-PCR檢測(cè)法2.2.2.1RT-PCR引物設(shè)計(jì)分別從GeneBank中獲取HLJ1和GAPDH的mRNA全長(zhǎng)序列（詳見附錄）。利用Primer5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。HLJ1引物：Forward：5’-ATATTGTGAAACCCGGAATG-3’Reverse：5’-TTTGCCTATTTATTTGACCC-3’產(chǎn)物長(zhǎng)度325bpGAPDH引物：Forward：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’Reverse：5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’產(chǎn)物長(zhǎng)度500bp現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一2.2.2.2組織總RNA提取

取肝癌組織和癌旁組織各100mg/mlTrizol，置于消毒硏砵中，加入液氮使之易于研磨粉碎。研磨粉碎后，加入1mlTrizol，室溫放置，解凍后繼續(xù)研磨成漿。要研磨細(xì)致，不要留有組織殘?jiān)?。成漿后吸入1.5mlEP管。冰上放置5分鐘。加入0.2ml

氯仿，用力震蕩30s，冰上靜置5min。4℃12000轉(zhuǎn)/min離心15min。取上清夜于另一EP管。加異丙醇0.5ml，震蕩1分鐘，冰上靜置15min。4℃12000轉(zhuǎn)/min離心10min，倒掉液體。加75％的酒精1ml，震蕩1min。4℃7500轉(zhuǎn)/min離心5min，倒掉液體，重復(fù)此步驟一次。短離心，將離心出來(lái)的殘液用小Tip頭吸凈。EP管置于濾紙上晾干。根據(jù)產(chǎn)量用DEPC處理的水30μl-50μl，溶解RNA。瓊脂糖凝膠電泳并測(cè)定OD值，分析提取RNA的純度和濃度?，F(xiàn)在是12頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一2.2.2.3第一鏈cDNA的合成逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，操作按RT-PCR試劑盒（DR019A）說(shuō)明書進(jìn)行。整個(gè)操作過(guò)程中要戴口罩帽子，并始終在冰上操作，采用20μl反應(yīng)體系。2.2.2.4PCR擴(kuò)增新合成的引物12000轉(zhuǎn)/min短暫離心，用消毒雙蒸水稀釋引物至100μM，將合成的第一鏈cDNA稀釋至100μl，取10μl作為模板，加引物PCR擴(kuò)增，采用20μl反應(yīng)體系，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。

現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一2.2.2.5電泳及分析結(jié)果

反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物4μl加2μl6×上樣緩沖液，于1.5％的瓊脂糖凝膠電泳（100V，15min），采用凝膠自動(dòng)分析儀計(jì)算產(chǎn)物的光密度值。2.2.3臨床病理特征研究

每例標(biāo)本均需記錄詳細(xì)的臨床病理特征，包括性別、肝硬化有無(wú)、結(jié)節(jié)數(shù)、腫瘤直徑；肝癌組織有無(wú)靜脈浸潤(rùn)及細(xì)胞分化程度資料由湘雅醫(yī)院病理科提供。HCC細(xì)胞分化根據(jù)Edmonson-Steiner分級(jí)而定[21]：Ⅰ－Ⅱ級(jí)癌細(xì)胞在形態(tài)上較接近正常肝細(xì)胞，分化較高；Ⅲ－Ⅳ級(jí)癌細(xì)胞胞核大而深染，胞漿少，分化低。鏡下見血管內(nèi)有癌細(xì)胞浸潤(rùn)伴血管內(nèi)皮染色不連續(xù)或見管腔內(nèi)有癌栓存在，即為靜脈浸潤(rùn)。腫瘤直徑為腫瘤組織的最大直徑。（見圖4）現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組臨床標(biāo)本按取材部位不同分為HCC組（n1=32）和PCLT組（n2=32）。檢測(cè)上述兩組中HLJ1mRNA的表達(dá)，比較組間HLJ1mRNA的表達(dá)水平的差異。根據(jù)RT-PCR結(jié)果，以32例肝細(xì)胞癌中HLJ1mRNA表達(dá)量的均數(shù)X1與對(duì)應(yīng)的32例癌旁組織中HLJ1mRNA表達(dá)量的均數(shù)X2的比值：X1/X2=0.61為界值，分為HLJ1低表達(dá)組(n1=18)和高表達(dá)組(n2=14)。每組再根據(jù)性別、肝硬化有無(wú)、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、腫瘤直徑、有無(wú)靜脈浸潤(rùn)、HCC細(xì)胞分化程度等臨床病理特征分組，形成四方表格資料，比較HLJ1表達(dá)水平與HCC臨床病理特征間的關(guān)系?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一2.4統(tǒng)計(jì)分析方法全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料的均數(shù)用X±SD表示，計(jì)量資料比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用Fisher’s確切概率法。以P≤0.05作為差異具有顯著性意義的界值。

現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一第三章結(jié)果3.1RNA質(zhì)量檢測(cè)

提取的組織RNA采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)18S、28S條帶明亮、清晰、銳利（圖1）。同時(shí)檢測(cè)了RNA在280nm和260nm的吸光度值，發(fā)現(xiàn)OD260/OD280（Ratio，R）比值均位于1.8~2.0之間（表1）。以上檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)，所提取的組織RNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)。現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一NLHCCPLCTHCCPLCT5S18S28S圖1：組織RNA瓊脂糖凝膠電泳圖NL：正常肝組織；HCC：肝癌組織；PLCT：癌旁組織現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一表1：組織RNA在280nm和260nm的吸光度值及吸光度比值樣品名稱吸光度值比值260nm280nmNL37.0119.2931.92HCC60.49930.9861.95PLCT60.85331.491.93HCC62.45232.3271.93PLCT47.14824.1561.95現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一3.2HLJ1在HCC和PLCT中的mRNA表達(dá)水平

32例肝癌組織及32例對(duì)應(yīng)的癌旁組織的RT-PCR結(jié)果顯示，HCC組織中HLJ1mRNA的表達(dá)水平為1.18±0.82，PLCT組織中HLJ1mRNA的表達(dá)水平為1.92±1.15，HCC組織中HLJ1的mRNA表達(dá)水平顯著性低于癌旁組織，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（圖2、圖3）現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一HCCHCCPLCTPLCTHLJ1GAPDH325bp500bp圖2：HLJ1RT-PCR結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖HCC：肝癌組織；PLCT：癌旁組織HCCPLCT相對(duì)表達(dá)量圖3：HLJ1RT-PCR統(tǒng)計(jì)分析直方圖HCC：肝癌組織；PLCT：癌旁組織現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一3.3HLJ1mRNA表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，兩者在腫瘤細(xì)胞分化程度（P=0.010）、靜脈浸潤(rùn)（P=0.001）方面的差異具有顯著性意義，而在性別、肝硬化有無(wú)、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目和腫瘤直徑方面無(wú)顯著性差異。（圖4，表2）現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一圖4：肝癌細(xì)胞分化程度和靜脈浸潤(rùn)的HE染色圖（×400倍）A：正常肝組織；B：Edmonson-Steiner分級(jí)Ⅰ級(jí)；C：Edmonson-Steiner分級(jí)Ⅱ級(jí)；D：Edmonson-Steiner分級(jí)Ⅲ級(jí)；E：Edmonson-Steiner分級(jí)Ⅳ級(jí)；F：鏡下靜脈浸潤(rùn)，箭頭所示。

ABCDEF現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一第四章討論

我們采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法，檢測(cè)了32例肝癌組織及32例對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的HLJ1基因的mRNA表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果顯示HCC組織中HLJ1mRNA的表達(dá)水平為1.18±0.82，PLCT中HLJ1mRNA的表達(dá)水平為1.92±1.15，兩者間存在顯著性差異，HCC組織中HLJ1mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05）。Tsai等運(yùn)用RT-PCR法測(cè)量HLJ1在71例非小細(xì)胞肺癌病人的癌與癌旁組織中的表達(dá)，亦發(fā)現(xiàn)HLJ1在癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，這與我們的研究結(jié)果一致[22]。研究證實(shí)，在HLJ1基因里有一個(gè)能驅(qū)動(dòng)其轉(zhuǎn)錄活性的區(qū)域，序列分析顯示此區(qū)缺失TATA盒，存在一個(gè)CCAAT盒，并有四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子YY1（Yin-Yang-1，又稱NF-E1）的結(jié)合位點(diǎn)，這也許對(duì)調(diào)控HLJ1的表達(dá)是重要的，轉(zhuǎn)錄因子YY1能夠增強(qiáng)HLJ1啟動(dòng)子活性，過(guò)表達(dá)YY1能增加HLJ1的表達(dá)[23]。HLJ1基因在肝癌組織中下調(diào)表達(dá)，亦可能是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子YY1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控所致，這有待于進(jìn)一步的深入研究。現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有28頁(yè)\編輯于星期一HCC的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素和多步驟的過(guò)程，其本身的各種生物學(xué)特性，比如細(xì)胞分化程度和靜脈浸潤(rùn)等