生理所黃阿敏

生理所黃阿敏第1頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六ComparisonofSouthern,Northern,andWesternanalysesofGeneX第2頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六SouthernhybridizationFirstdescribedbyE.M.Southernin1975.ApplicationsofSouthernhybridizationRFLP’s,VNTR’sandDNAfingerprintingCheckingofthegeneknockoutmiceTheflowchartofSouthernhybridization第3頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六SouthernhybridizationTransferbuffer第4頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六DetectionofanRFLPbySouthernblotting第5頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Detectionofthesickle-cellglobingenebySouthernblotting第6頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Checkingofthegeneknockoutmice第7頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六FlowchartofSouthernhybridizationPreparingthesamplesandrunningthegelSoutherntransferProbepreparationPrehybridizationHybridizationPost-hybridizationwashingSignaldetectionIsotopeNon-isotope第8頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六PreparingthesamplesandrunningthegelDigest10pgto10gofdesiredDNAsamplestocompletion.Prepareanagarosegel,loadsamples(remembermarker),andelectrophorese.Staingelethidiumbromidesolution(0.5g/ml).Photographgel(withruler).第9頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Criticalparameters(I)NotethecomplexityofDNAGenomicDNAAsingle-copyofmammaliangene,3Kbaverageinlength10mgx3Kb/3x106Kb=10mgx1/106=10pgPlasmidDNAorPCRproducts0.1mgofa3KbplasmidDNA100ng第10頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六GeltreatmentAcidtreatment0.2NHClsolutionDenaturationNaOHsolutionNeutralizationTris-Clbuffer(pH8.0)第11頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六SoutherntransferMeasuregelandsetuptransferassembly:Wickintraywith20xSSCGelNitrocelluloseorNylonfilters(soakedinH2Oand20xSSC)3MMWhatmanfilterpaperPapertowelsWeight第12頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六AfterSoutherntransferDissembletransferpyramidandrinsenitrocellulosein2xSSCBakenitrocelluloseat80Cfor2hrorUV-crosslinkNylonmembraneforseconds第13頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六PreparationofprobesSynthesisofuniformlylabeleddouble-strandedDNAprobesPreparationofsingle-strandedprobesLabelingthe5and3terminiofDNA第14頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Synthesisofdouble-strandedDNAprobesNicktranslationofDNALabeledDNAprobesusingrandomoligonucleotideprimers第15頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Nicktranslation第16頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Preparationofsingle-strandedprobesSynthesisofsingle-strandedDNAprobesusingbacteriophageM13vectors.SynthesisofRNAprobesbyinvitrotranscriptionbybacteriophageDNA-dependentRNApolymerase.第17頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Invitrotranscription第18頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六

Labelingthe3terminiofdouble-strandedDNAusingtheKlenowfragmentofE.coliDNApolymeraseI.(lackof5’3’exonucleaseactivity)Labelingthe3terminiofdouble-strandedDNAusingbacteriophageT4DNApolymerase.Labelingthe5terminiofDNAwithbacteriophageT4polynucleotidekinase.Labelingthe5and3terminiofDNA第19頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六T4polynucleotidekinaseactivity第20頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Non-isotopelabelingDigoxigenin-11-dUTP(DIG-dUTP)labelingDNAlabelingOligonucleotidelabelingRNAlabeling第21頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六PCRLabeling,RandomPrimedLabeling,andRNALabeling第22頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六PrehybridizationAddprehybridizationsolutionandprehybridizeathybridizationtemperaturefor2-4hr第23頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六HybridizationRemoveprehybridizationsolutionandaddhybridizationsolutionAdd500,000cpmoftheprobe/mlhybridizationsolution.Hybridizeovernightatappropriatetemperature.第24頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Post-hybridizationwashingWashtwice,15mineach,in1xSSC,0.1%SDSatroomtemperature.Washtwice,15mineach,in0.25xSSC,0.1%SDSathybridizationtemp第25頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Criticalparameters(II)HomologybetweentheprobeandthesequencesbeingdetectedTm=81+16.6(logCi)+0.4[%(G+C)]-0.6(%formamide)-600/n-1.5(%mismatch)Factorscanbechanged:Hybridizationtemp.Washingtemp.SaltconcentrationduringwashingHightemp.,lowsalt:highstringencyLowtemp.,highsalt:lowstringencyIf50%formamideisused42oCfor95~100%homology37oCfor90~95%homology32oCfor85~90%homology第26頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六ComparisonofnitrocelluloseandnylonmembranesNCNylonHydrophobicbindingCovalentbindingFragileDurableProbelength>200~300bp<200~300bpisO.K.LowerbackgroundHigherbackgroundCannotbeexposedtobasicsolutionCanbeexposedtobasicsolutionNoteasilyreprobedCanbereprobedseveraltimes第27頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六SignalsdetectionAutoradioragraphyNon-isotopedetectionsystemChemiluminescentdetectionColorimetricdetectionMulticolordetection第28頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六AutoradiographyExposuretox-rayfilm第29頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六NorthernblottingorNorthernhybridizationTechniquefordetectingspecificRNAsseparatedbyelectrophoresisbyhybridizationtoalabeledDNAprobe.第30頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六TheflowchartofNorthernhybridizationPrepareRNAsamplesandrunRNAgelNortherntransferProbepreparationPrehybridizationHybridizationPost-hybridizationwashingSignaldetectionIsotopeNon-isotope第31頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Preparationofagarose/formaldehydegelE.g.Preparea350ml1.2%agarose/formaldehydegel4.2gagarosein304.5gwater.Microwave,thencoolto60C.Add35ml10xMOPSrunningbufferand10.5ml37%formaldehyde第32頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六PreparationofRNAsamplesPrepareapremix:5lof10xMOPSrunningbuffer8.75lof37%formaldehyde25lofformamide.PrepareRNAsamples:38.75lofpremixRNA(0.5to10g)*waterto50l*IfthemRNAspeciesofinterestmakesuparelativelyhighpercentageofthemRNAinthecell(>0.05%ofthemessage),totalcellularRNAcanbeused.IfthemRNAspeciesofinterestisrelativelyrare,however,itisadvisabletousepoly(A)+RNA.Incubate15minat55C第33頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六RunningtheRNAgelAdd10lformaldehydeloadingbuffertoeachsampleandloadgel.Rungelat100to120Vfor~3hr.Removegelfromtherunningtankandrinseseveraltimesinwater.Placegelin10xSSCfor45min.Donotneedpost-transferringgeltreatment第34頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六AnexampleofNorthernblottingNorthernblotRNAgel28S18S第35頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六Westernblotting,orimmunoblottingTechniquefordetectingspecificproteinsseparatedbyelectrophoresisbyuseoflabeledantibodies.第36頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六FlowchartofWesternblottingElectrophoresingtheproteinsampleAssemblingtheWesternblotsandwichTransferringproteinsfr