細胞融合定稿

細胞融合定稿第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六細胞融合的應(yīng)用領(lǐng)域

細胞融合（cellfusion)

是細胞工程技術(shù)的重要手段之一，是研究細胞遺傳、基因定位、細胞免疫、病毒和腫瘤的重要手段。第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六顯微鏡下細胞融合過程第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋的變化過程圖解第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六融合的助融劑依據(jù)融合過程采用的助融劑不同，細胞融合可分為：病毒誘導(dǎo)的細胞融合，如仙臺病毒（HVJ）；化學(xué)因子誘導(dǎo)的細胞融合，如聚乙二醇（PEG）；電場誘導(dǎo)的細胞融合；激光誘導(dǎo)的細胞融合第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細胞融合過程示意圖第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六實驗?zāi)康牧私饩垡叶迹≒EG）誘導(dǎo)體外細胞融合的基本原理。通過PEG誘導(dǎo)雞血細胞之間的融合實驗，初步掌握細胞融合的基本方法。第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六實驗原理PEG是乙二醇的多聚化合物，可改變各類細胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處脂類分子發(fā)生疏散和重組，誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞融合。商品PEG存在一系列不同分子質(zhì)量的多聚體，一般應(yīng)用PEG4000~6000的溶液，能夠產(chǎn)生高頻率的細胞融合。第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六PEG誘導(dǎo)融合的特點優(yōu)點：是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點：是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。

第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六實驗儀器、用具注射器滴管燒杯容量瓶載玻片離心機水浴鍋顯微鏡酒精燈蓋玻片第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六試劑Hanks原液（10×）NaCl280.0gNa2HPO4·12H2O1.2gKCl4.0gKH2PO40.6gMgSO4·7H2O2.0g葡萄糖10.0gCaCl21.4g第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六試劑Hanks原液（10×）稱取1.4gCaCl2，溶于30-50ml蒸餾水中取1000mL的燒杯及容量瓶各1個，先放重蒸水800mL于燒杯中，然后按上頁表順序逐一溶解藥品。直到葡萄糖完全溶解后，再將已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水定容至1000mL第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六試劑Hanks液Hanks原液100mL重蒸水896mL0.5%酚紅4mL配好的Hanks液，分裝包扎好貼上標(biāo)簽，經(jīng)過滅菌后，4℃保存。第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六試劑生理鹽水50%（m/V）PEG溶液稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化之，迅速加入1ml預(yù)熱的Hanks液混勻制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六方法與步驟1.雞血細胞儲備液的制備（已完成）取雞血，加入肝素（100U/5mL全血）制成抗凝全血。再加入4倍體積生理鹽水，制成紅細胞儲備液2.雞血細胞的處理用5mL離心管取雞血細胞儲備液1mL，加入4mL生理鹽水，混勻后，800rpm離心5min，棄上清，用5mL生理鹽水重懸浮沉淀，重復(fù)離心操作1次。第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六方法與步驟3.雞血細胞懸液的制備在離心后的雞血細胞沉淀中加入2mlHanks緩沖液，將細胞懸浮，于37℃保溫。4.PEG誘導(dǎo)細胞融合吸取1mL雞血懸液放在10mL離心管中，逐滴加入37℃的50%PEG約0.5mL,邊加邊輕輕搖動，1min加完，混勻后于37℃水浴靜置3min。第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六方法與步驟5.終止PEG作用緩慢加入5mLHanks緩沖液，輕輕吹打混勻，于37℃水浴中靜置5min。6.制備細胞懸液用吸管輕輕吹打細胞團數(shù)次使其分散，離心使細胞沉淀，用1-2mLHanks緩沖液重懸浮。7.鏡檢吸取細胞懸液，在凹面載玻片上滴一滴，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察細胞融合情況。第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六注意事項溫度、融合時間、PEG的濃度與作用時間、細胞密度、機械力等因素均影響融合率，實驗操作時應(yīng)予以注意，并在需要的時候及時鏡檢。第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六實驗結(jié)果第20頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六計算細胞融合率細胞融合率是指在顯微鏡的視野內(nèi)，已發(fā)生融合細胞的細胞核總數(shù)與該視