§3-1酶工程概述課件

§3酶工程河南工業(yè)貿(mào)易職業(yè)學院糧食與生物工程系本章主要內(nèi)容§3-1酶工程概述一、酶的基本概念、分類和命名二、酶工程的概念、內(nèi)容、研究進展§3-2酶工程的內(nèi)容一、食品酶的生產(chǎn)與分離純化二、酶的改造與修飾三、酶的固定化四、酶反應(yīng)器本章主要內(nèi)容§3-3酶工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用一、酶工程與食品加工二、酶工程與食品添加劑三、酶工程與功能性食品配料四、酶工程與食品原料改良一、酶的基本概念、分類和命名1、酶的概念2、酶的催化特性3、酶的分類4、酶的命名1、酶的概念酶：來自于生物細胞的具有催化功能的特殊蛋白質(zhì)，其催化具有高效性、專一性，而且反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)產(chǎn)物易純化酶是生命活動的推動機2、酶的催化特性催化效率高專一性高反應(yīng)條件溫和活性可調(diào)節(jié)其催化活性離不開輔酶、輔基以及金屬離子的作用2H2O22H2O+O21mol過氧化氫酶5×106molH2O21mol離子鐵6×10-4molH2O23、酶的分類氧化還原酶轉(zhuǎn)移酶水解酶裂合酶異構(gòu)酶連接酶或合成酶表3-14、酶的命名習慣命名法系統(tǒng)命名法二、酶工程的基本概念、內(nèi)容和研究進展1、酶工程的概念2、酶工程的內(nèi)容3、酶工程發(fā)展簡史1、酶工程的概念酶工程：指酶的生產(chǎn)和應(yīng)用過程酶的生物合成法生產(chǎn)酶的分離純化酶分子修飾酶和細胞固定化酶的非水相催化酶反應(yīng)器酶在醫(yī)藥、食品、輕工、化工、環(huán)保、能源領(lǐng)域的應(yīng)用2、酶工程的構(gòu)成生物酶工程（高級酶工程）克隆酶、突變酶、新酶化學酶工程（初級酶工程）指自然酶，化學修飾酶，固定化酶，化學人工酶3、酶工程發(fā)展簡史1894年，日本高峰讓吉首先從米曲霉中制得高峰淀粉酶，用作消化劑。1898年，德國的羅姆Rohm制得胰酶，用于皮革軟化。1908年法國Boidin制備得細菌淀粉酶，用于紡織品退漿1911年，美國的華勒斯坦（Wallerstein）制得木瓜蛋白酶，用來去除啤酒中的蛋白質(zhì)渾濁。原料來源、分離純化技術(shù)限制，將近半個世紀都停留在從動物、植物、微生物細胞中提取酶并應(yīng)用1949年，用微生物液體深層培養(yǎng)法進行細菌α－淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)，揭開了近代酶工業(yè)的序幕。20世紀50年代開始：從微生物發(fā)酵液中分離出一些酶，制成酶制劑。許多酶制劑開始使用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)工業(yè)化生產(chǎn)開始20世紀80年代植物細胞培養(yǎng)：SOD、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、過氧化物酶、糖苷酶、糖化酶等動物細胞培養(yǎng)：膠原酶、血纖維蛋白溶酶原活化劑動植物細胞培養(yǎng)技術(shù)成為酶生產(chǎn)又一途徑酶生產(chǎn)發(fā)展，應(yīng)用也越來越廣泛獨特優(yōu)勢：專一性強、催化效率高、作用條件溫和等應(yīng)用拓寬：醫(yī)藥、食品、化工、能源、環(huán)保和科研等領(lǐng)域大多數(shù)酶不能耐高溫、強酸、強堿、有機溶劑等作用，穩(wěn)定性差酶通常在水溶液中與底物作用，只能作用一次酶在反應(yīng)液中與反應(yīng)產(chǎn)物混在一起，產(chǎn)品分離純化時較困難工業(yè)化、細胞培養(yǎng)應(yīng)用中存在的問題無意的發(fā)現(xiàn)：

1916，美國奈爾森和格里芬將蔗糖酶吸附在骨炭上，該酶仍具催化活性目標明確的開發(fā)：1953，德國的格魯布霍費和施米斯首先將聚氨基苯乙烯樹脂重氮化，然后將淀粉酶、胃蛋白酶等結(jié)合其上，制成固定化酶20世紀60年代，固定化技術(shù)迅速發(fā)展1969，日本千畑一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；高M行D、L氨基酸拆分，而生產(chǎn)L氨基酸1971，在美國舉行了第一屆國際酶工程學術(shù)會議，會議的主題是固定化酶固定化酶技術(shù)的發(fā)展固定化酶的優(yōu)勢和不足

優(yōu)勢：提高穩(wěn)定性，可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長的一段時間按，易于與產(chǎn)物分離等

不足：固定化技術(shù)較為繁雜，而且用于固定化的酶要首先經(jīng)過分離純化1973，日本成功地利用固定化大腸桿菌菌體中的天冬氨酸酶由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸固定化酶技術(shù)→固定化菌體死細胞或靜止細胞1978，日本鈴木等人用固定化細胞生產(chǎn)α-淀粉酶研究成功之后，相繼用于生產(chǎn)蛋白酶、糖化酶、果膠酶、溶菌酶、天冬酰胺酶等固定化細胞的優(yōu)勢與不足

優(yōu)勢：

固定化細胞可反復(fù)或連續(xù)用于酶的發(fā)酵生產(chǎn)，有利于提高酶的產(chǎn)率縮短發(fā)酵周期

不足：但固定化細胞只能用于生產(chǎn)胞外酶等容易分泌到細胞外的產(chǎn)物固定化酶、菌體技術(shù)→固定化細胞活細胞或增殖細胞原生質(zhì)體

解除了細胞壁這個擴散障礙有助實現(xiàn)胞內(nèi)酶的連續(xù)生產(chǎn)胞內(nèi)酶的原生質(zhì)體固定化技術(shù)酶的化學本質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能酶分子修飾方法主要有酶分子主鏈修飾酶分子側(cè)鏈基團修飾酶分子組成單位置換修飾酶分子中金屬離子置換修飾等酶的分子修飾修飾酶：水溶性固定化酶：水不溶性共同目的：提高酶活力，增加酶穩(wěn)定性消除或降低酶的抗原性等修飾酶和固定化酶蛋白質(zhì)工程，20世紀80年代中期發(fā)展起來的蛋白質(zhì)工程將酶分子修飾與基因工程技術(shù)結(jié)合在一起蛋白質(zhì)工程：通過定位突變技術(shù)，把酶分子修飾后的信息儲存于DNA之中，經(jīng)過基因克隆和表達，就可通過生物合成的方法，不斷獲得新的特性和功能的酶，使酶分子修飾的應(yīng)用前景更廣闊蛋白質(zhì)工程與酶分子修飾

60年代后：固定化酶，固定化細胞的崛起。

70年代后期：微生物學，遺傳工程，細胞工程的應(yīng)用技術(shù)面貌一新。已發(fā)現(xiàn)和鑒定的酶有8000多種，大規(guī)模運用商品酶只有數(shù)十種（16種），小批量生產(chǎn)的有百來種。

自然酶在工業(yè)應(yīng)用上受限制的原因有：（1）多數(shù)酶脫離其生理環(huán)境后極不穩(wěn)定，在生產(chǎn)和應(yīng)用過程中的條件與其生理環(huán)境相去甚遠（2）酶的分離純化工藝復(fù)雜（3）酶制劑成本高§3-2酶工程的內(nèi)容一、食品酶的生產(chǎn)與分離純化二、酶的改造與修飾三、酶的固定化四、酶反應(yīng)器一、食品酶的生產(chǎn)與分離純化1、酶的生產(chǎn)方法2、微生物發(fā)酵產(chǎn)酶3、酶的提取與分離純化4、酶的濃縮、干燥和結(jié)晶1、酶的生產(chǎn)方法提取分離法動植物器官、組織、細胞和微生物細胞中酶的提??；最早采用；也是其他生產(chǎn)方法中的技術(shù)環(huán)節(jié)生物合成法利用微生物、動植物細胞的生命活動獲得所需酶化學合成法人工合成酶，局限于實驗室的技術(shù)，成本高動物胰臟——胰酶木瓜——木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶菠蘿皮——菠蘿蛋白酶提取分離法其他生產(chǎn)方法不可或缺的技術(shù)環(huán)節(jié)設(shè)備簡單，操作方便但原料來源受限，優(yōu)良產(chǎn)酶細胞篩選→生物反應(yīng)器中細胞培養(yǎng)→生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物→分離純化→酶產(chǎn)品微生物細胞產(chǎn)酶——發(fā)酵法動植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

大蒜細胞培養(yǎng)→SOD

木瓜細胞培養(yǎng)→木瓜蛋白酶等生物合成法生產(chǎn)周期短，產(chǎn)率高2、微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生產(chǎn)的發(fā)酵方法產(chǎn)酶細胞的要求酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物酶生產(chǎn)的主要發(fā)酵方法液體深層發(fā)酵技術(shù)枯草桿菌→淀粉酶、蛋白酶大腸桿菌→谷氨酸脫羧酶、多核苷酸聚合酶黑曲霉→糖化酶、果膠酶固定化細胞發(fā)酵→胞外酶固定化原生質(zhì)體發(fā)酵→胞內(nèi)酶酶制劑的生產(chǎn):

提取法生產(chǎn)方法發(fā)酵法化學合成法

提取和分離純化

酶的固定化

總結(jié)：目前工業(yè)上大多采用微生物發(fā)酵法來獲得大量的酶制劑。此法的優(yōu)點在于微生物不受氣候、地理等條件的限制、繁殖速度快。還可以根據(jù)需要選育菌種來提高產(chǎn)酶率。

產(chǎn)酶細胞的要求酶的產(chǎn)量高容易培養(yǎng)和管理產(chǎn)酶穩(wěn)定性好利于酶的分離純化安全可靠酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物枯草芽孢桿菌大腸桿菌黑曲霉米曲霉青霉木霉根霉毛霉鏈霉菌（葡萄糖異構(gòu)酶）啤酒酵母假絲酵母3、酶的提取與分離純化微生物細胞破碎——胞內(nèi)酶酶的提取常用方法酶的精制純化常用方法酶提取過程中的注意事項酶分離純化的一般原則抽提純化制劑酶制劑生產(chǎn)三步驟酶的提取、分離純化技術(shù)路線細胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。微生物細胞破碎——胞內(nèi)酶機械破碎法高壓勻漿法珠磨法超聲波破碎法非機械破碎法酶溶法、化學滲透法JY92-IID超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型電動玻璃勻漿機機械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細胞破碎。通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細胞破碎細胞破碎方法及其原理酶的提取是指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。酶的提取為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。酶提取的主要方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團的酶大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。酶精制純化的主要方法沉淀分離離心分離過濾與膜分離層析分離電泳分離萃取分離沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。沉淀分離的主要方法

鹽析法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法離心分離離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件離心分離——認識幾種離心機常速離心機又稱為低速離心機其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1×104g以下在酶的分離純化過程中，主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。高速離心機最大轉(zhuǎn)速為（1～2.5）×104r/min

，相對離心力達到1×104～1×105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機。超速離心機最大轉(zhuǎn)速達(2.5～12)×104r/min，相對離心力可以高達5×105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。過濾分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動物細胞、植物細胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜層析分離方法層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外電泳分離帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為：

紙電泳薄層電泳薄膜電泳凝膠電泳自由電泳等電聚焦電泳

4酶的濃縮、干