同工酶SOD綜合試驗(yàn)

大蒜超氧化物歧化酶(SOD)性質(zhì)研究.綜合實(shí)驗(yàn)姓名：學(xué)號：班級：學(xué)院：同組成員:指導(dǎo)老師:時(shí)間：[1]目錄TOC\o"1-5"\h\z封面1目錄2摘要3關(guān)鍵詞3緒論3實(shí)驗(yàn)材料：試劑4儀器設(shè)備5實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：酶液提取5酶的性質(zhì)6同工酶類型判斷（電泳）7酶活力的測定9結(jié)果與討論：\o"CurrentDocument"結(jié)果分析10實(shí)驗(yàn)過程以及結(jié)果的討論和注意事項(xiàng)11參考文獻(xiàn)12搞震：SOD廣泛存在生物界，是防御氧毒害的關(guān)鍵酶。SOD主要有CuZn-,Mn-,Fe-SOD三種類型的同工酶，它們的共同的生物學(xué)作用是專一的清除氧化中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（對細(xì)胞組分及細(xì)胞器，尤其是生物膜有嚴(yán)重的損壞作用），具有抗衰老，抗輻射，抗癌等生理作用。在醫(yī)藥中，SOD可用于治療輻射病，自身免疫性疾病，炎癥等;在食品中，可用于保健食品添加劑；在化妝品中，可防止皮膚衰老，抗炎，防曬等作用。植物中大蒜的SOD含量豐富，所以，本實(shí)驗(yàn)研究大蒜中SOD的性質(zhì)，并且確定SOD同工酶的類型。根據(jù)SOD的性質(zhì)，我們采用鄰苯三酚自氧化法判斷同工酶的最適溫度，最適PH,以及雙氧水對酶的活力抑制。并采用改進(jìn)的自氧化法測酶的活力.劣鍵伺：SOD同工酶最適溫度最適PH抑制劑鄰苯三酚自氧化NBT光化還原分光光度計(jì)二.徒倫SOD廣泛存在生物界，是防御氧毒害的關(guān)鍵前。具有抗衰老，抗輻射，抗癌等生理作用。在醫(yī)藥中，SOD可用于治療輻射病，自身免疫性疾病，炎癥等；在食品中，可用于保健食品添加劑；在化妝品中，可防止皮膚衰老，抗炎，防曬等作用。本實(shí)驗(yàn)研究大蒜中SOD的性質(zhì)，并且確定SOD同工酶的類型。通過本實(shí)驗(yàn)，掌握不連續(xù)凝膠電泳的基本操作技能，同時(shí)養(yǎng)成認(rèn)真,嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)態(tài)度。宏爹材料①試劑：2.4-5X10-3mol/LNBT溶液：稱取200mgNBT溶于蒸餡水中并定容至100ml置棕色試劑瓶中，避光4K貯存。3.60x10-2mol/LPH7.8磷酸緩沖液(內(nèi)含2.8XlOfol/LTEMED和2.8xlO—mol/L維生素B?)：在100ml3.60x10-2mol/LPH7.8磷酸鈉緩沖液中加0.42mlTEMED及L32mg維生素B?，置棕色瓶中4K貯存。PH8.3Tris-甘氨酸電極緩沖液：稱取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加水至1000ml,用是加水稀釋10倍。PH8.91.5mol/LTris-HCl緩沖液：稱取18.2g三羥甲基氨基甲烷(Tris)加24mllmol/L鹽酸，加水至100ml.PH6.80.5mol/LTris-HCl緩沖液：稱取Tris6.0g,加48ml1.0mol/L鹽酸溶液100ml。以及不同濃度的磷酸緩沖液。/凝膠貯液以及凝膠A液：48mllmol/LHcl,36gTris,0.24mlTEMED.B液：48mllmol/LHcl,5.9gTris,0.46mlTEMEDoC液：30gAcr,0.8gBisD液：10gAcr,2.5gBisE液：4mg核黃素F液：40g蔗糖（以上各液定容至100ml）凝膠（體積比）:A:C:E:水二1:3:1:3濃縮液（體積比）：B:D:E:F=1:3:1:3②儀器設(shè)備：離心機(jī)2.水浴鍋3.電熱爐4.研缽5.721型分光光度計(jì)以及紫外分光光度計(jì)賓爹內(nèi)容制備酶液：S0D的提取：稱取20-25g大蒜蒜瓣，置于研磨器中研磨，使組織細(xì)胞破碎。再加入2~3倍體積的0.05mol/LPH7.8的磷酸緩沖液,繼續(xù)研磨，攪拌20min,使SOD充分溶解到緩沖液中，然后以5000r/min離心15min,棄去沉淀，得提取液。（留取lml提取液備用，正確量取剩余上清液體積，記錄）?除雜蛋白向提取液中加入0.25倍體積的氯仿?乙醇混合液，攪拌15min,5000r/min,離心15min,棄除雜蛋白,得粗酶液。（留取lml粗酮液備用，正確量取剩余粗酶液的體積，記錄）SOD的沉淀分離。將上述粗酶液加入等體積的冷丙酮，攪拌15min,5000r/min,離心15min得SOD沉淀。將SOD沉淀溶于0.05mol/LPH7.8的磷酸緩沖液中，于55~60°C熱處理15min,再離心棄沉淀的得SOD酶液（留取lml酶液備用，正確量取剩余酶液的體積，記錄）②SOD性質(zhì)的測定：1.粗酶液活性測定（鄰苯三酚法）試劑ml空白管對照管提取液粗酶液酶液PH8.3磷酸緩沖液33333SOD提取液000.10.10.1蒸僧水21.81.71.71.7室溫放置20min鄰苯三酚00.20.20.20.2吸光值00.230.2150.2100.188加入鄰苯三酚后迅速混勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)4min,加一滴濃Hcl停止反應(yīng)，在420nm下測定吸光值。2.酶液的最適溫度探究管試劑福1、23、4號5號溫度處理（°C）0255075100PH8.3磷酸緩沖液33333SOD酶液0.10.10.10.10.1蒸館水22222在各自的溫度下靜置lOmin,然后取出鄰苯三酚0.20.20.20.20.2吸光值00.420.330.030.958加入鄰苯三酚后迅速混勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)4min,加一滴濃Hcl停止反應(yīng)，在420nm[6]

下測定吸光值。3.酶液的最適PH探究試管試劑ml123456SOD酶液0.10.10.10.10.10.1磷酸緩沖液(PH)5.86.57.07.37.67.9蒸儒水222222在最適溫度下，水浴lOmin,取出鄰苯三酚0.20.20.20.20.20.2吸光值00.005未作0.0170.0290.0154.抑制劑對酶液活性的影響(1)珥對SOD活力抑制試管試^012341.5%H2O215pl20pl25uL30ulSOD酶液0.10.10.10.1于30°C水浴恒溫30min,取出迅速冷卻至25°C鄰苯三酚0.20.20.20.2吸光值0.060.0390.0720.085③同工酶類型的判斷：(不連續(xù)電泳)將玻璃板用蒸儲水洗凈晾干，準(zhǔn)備2個干凈的錐形瓶.把玻璃板在灌膠支架上固定好固定玻璃板時(shí)，兩邊用力一定要均勻,防止夾壞玻璃板.按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約5厘米左右，之后加少許蒸僧水，靜置40分鐘.凝膠配制過程要迅速，催化劑TEMED要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無法注膠.注膠過程最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡.水封的目的是為了使分離膠上延平直,并隔絕空氣，凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳，靜置40分鐘.樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平.在上槽內(nèi)加入緩沖液后，拔出樣梳.要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出，否則會影響加樣效果.加樣，取10u1樣品溶液,再加入10ul2倍樣品緩沖液，上樣量分別為5u1和3u1.按下表用微量注射器距槽底三分之一處加樣，加樣前,樣品在沸水中加熱3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合.（注射器不可過低,以防刺破膠體，也不可過高，在樣下沉?xí)r會發(fā)生擴(kuò)散.為避免邊緣效應(yīng)，最好選用中部的孔注樣?）槽口12345試劑SOD酶液和h202SOD酶液SOD酶液和h202SOD酶液SOD酶液1234n8.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進(jìn)行電泳，開始電流恒定在10mA,當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA,漠酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳.9.SOD活性染色取凝膠板，按下列順序浸泡于培養(yǎng)皿中染色2.45X10-3mol/LNBT溶液中,再黑暗條件下浸泡20min,NBT溶液應(yīng)置于暗處，4°C貯存以免氧化變質(zhì)，染色時(shí)也至于暗處，如凝膠板厚可延長浸泡時(shí)間置于3.60X10-2mol/LPH7.8磷酸緩沖液(內(nèi)含2.8X10-2mol/LTEMED和2.8XlO-mol/L維生素B?)中，在黑暗條件下浸泡15min將凝膠板移入5.0X10-2mol/LPH7.8磷酸鈉緩沖液中浸泡，在4X8W日光燈下照20-30min,光照應(yīng)均勻，使無SOD區(qū)的NBT充分還原成藍(lán)紫色的甲月替。經(jīng)上述染色和光照后的凝膠板，在藍(lán)色背景上出現(xiàn)清晰透明的SOD活性染色。染色后的凝膠板用水漂洗數(shù)次后,再用保存液浸泡。⑴鄰苯三酚自氧化速率的測定：在試管中加入緩沖液4.5ml,于25°C保溫20min,然后加入預(yù)熱的鄰苯三酚10凹(對照管用1()mmol/LHCl代替)，迅速搖勻倒入1cm光徑的比色皿，在325nm下，每隔3()s測吸光度一次，可適當(dāng)調(diào)整鄰苯三酚加入量，將自氧化速率控制在0.070A/min.SOD或粗酶液的活性測定:在試管中加入約10口酶夜，其它操作同自氧化速率的測定，按下列公式計(jì)算酶活力：0.070-祥液速宰單位體積活力(U/ml)=嘉X反應(yīng)液總體積50%樣液稀釋倍數(shù)X樣液體積總活力單位數(shù)（U）=每毫升酶夜活力單位數(shù)x酶夜的總體積⑴自氧化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：0.395,0.738,1.060,1.260,1.395,1.481,1.553,1.678.⑵加入酶液：0.102,0.273,0.421,0.517,0.611,0.682,0.742,0.742彩果與村俗①結(jié)果分析（1）通過對大蒜S0D酶提取液，粗酮液及酶液的鄰苯三酚自氧化法測定的吸光值可知SOD的活力越大，與鄰苯三酚作用后顏色越淺，吸光值越小。（2）根據(jù)鄰苯三酚自氧化法測定SOD酶活力的原理，當(dāng)酮處在最適溫度，最適PH條件下時(shí)酶活力最大。用420nm波長測定吸光值越小，對照實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可知SOD同工酶最適溫度為75度左右，最適PH在8左右。（3）在分析H202對SOD的活力影響時(shí)，有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)知當(dāng)所加的H202量逐漸增多時(shí)，吸光光度值逐漸增大，及酶的活力逐漸減小。所以H202對SOD有抑制作用。（4）用不連續(xù)電泳測同工酶類型時(shí)，可以看到有2條光亮的條帶。（5）酶活力的測定中，由于對稀釋倍數(shù)不是很明確，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大偏差，不具有正確性.②實(shí)驗(yàn)過程以及結(jié)果的討論和注意事項(xiàng)本實(shí)驗(yàn)采用未改進(jìn)的鄰苯三酚自氧化法定性測定SOD酮的性質(zhì)(最適溫度，最適PH以及抑制劑)方法比較簡單且結(jié)果直觀明了，但由于鄰苯三酚自氧化過程受溫度及PH的影響明顯。尤其鄰苯三酚對PH很靈敏。操作過程必須十分注意加樣順序，防止所測結(jié)果僅是PH及溫度對鄰苯三酚的影響，而不是對SOD活力的影響。在試驗(yàn)過程中，為保證酶未失效，每天必須重新從大蒜中提取酮液，當(dāng)天提取當(dāng)天使用，并且要注意不用時(shí)應(yīng)置于冰箱中4度保存。在用不連續(xù)電泳測定同工酶類型時(shí)，由于實(shí)驗(yàn)條件以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)材料的缺乏，只能定性分析SOD同工酶的類型，無法判斷那一條光帶對應(yīng)何種類型的同工酶。且經(jīng)電泳后出現(xiàn)2條明顯的亮帶與理論上應(yīng)有三條帶存在偏差。可能的原因：①選擇的大蒜中其中2種類型的防含量豐富，而第三種酶含量很少。②電泳時(shí)間不夠，三條帶還未能充分分離開來。同時(shí)在電泳的操作過程中，凝膠十分重要，在本次試驗(yàn)中,第一次操作中由于我們組濃縮膠的凝膠不是很好，加入樣品后，在電泳的過程中，出現(xiàn)了向旁邊擴(kuò)散的現(xiàn)象，因而作廢，只能進(jìn)行重新凝膠。（4）在測定酮的活力過程中，因?yàn)槿雍芪⒘?，且在PH為8的堿性條件下反應(yīng)很迅速，因而操作必須熟練，快速，每隔30S記錄一次數(shù)據(jù)，直至4m