紫外分光光度法課件

第六章紫外吸收光譜分析

第一節(jié)光的基本性質(zhì)

一、光學(xué)分析法（一）光學(xué)分析法依據(jù)物質(zhì)發(fā)射的電磁輻射或物質(zhì)與電磁輻射相互作用而建立起來的各種分析法的統(tǒng)稱。

（二）分類：1．光譜法：利用物質(zhì)與電磁輻射作用時，物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化能級躍遷而產(chǎn)生的吸收、發(fā)射或散射、輻射等電磁輻射的強(qiáng)度隨波長變化的定性、定量分析方法按能量交換方向分吸收光譜法發(fā)射光譜法按作用結(jié)果不同分原子光譜→線狀光譜分子光譜→帶狀光譜3、發(fā)射光譜4、吸收光譜例：γ-射線；x-射線；熒光例：原子吸收光譜，分子吸收光譜二、光譜法儀器——分光光度計主要特點(diǎn)：五個單元組成光源單色器樣品池檢測器記錄裝置三、光的基本性質(zhì)

光是一種電磁波，具有波動性和微粒性

1、波動性

2、微粒性

第二節(jié)紫外吸收光譜的基本原理

一、分子吸收光譜的產(chǎn)生

能級：電子能級、振動能級、轉(zhuǎn)動能級①價電子運(yùn)動：電子繞原子核作相對運(yùn)動②原子振動：分子中原子或原子團(tuán)在其平衡位置上作相對振動③分子轉(zhuǎn)動：整個分子繞其重心作旋轉(zhuǎn)運(yùn)動④分子平動：躍遷：電子受激發(fā)，從低能級轉(zhuǎn)移到高能級的過程E分子=E電子+E振動+E轉(zhuǎn)動+E平動式中：E電子――代表分子中電子躍遷的能量E振動――代表分子的振動能量E轉(zhuǎn)動――代表分子的轉(zhuǎn)動能量，和分子的轉(zhuǎn)動慣量有關(guān)E總――代表分子的總能量E平動――代表分子的平動能量，只和溫度有關(guān)，對分子吸收光譜意義不大，可以不考慮

按照量子力學(xué)的觀點(diǎn)，分子吸收外界能量時，只能吸收等于兩個能級之差的能量，否則不能被吸收。

式中：E2――終止態(tài)的能量E1――起始態(tài)的能量△E――光子的能量分子的“電子光譜”是由許多線光譜聚集在一起的帶光譜組成的譜帶，稱為“帶狀光譜”。由于各種物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同對不同能量的光子有選擇性吸收吸收光子后產(chǎn)生的吸收光譜不同利用物質(zhì)的光譜進(jìn)行物質(zhì)分析的依據(jù)。二、光的吸收定律

當(dāng)一束平行的單色光照射均勻的有色溶液時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液，一部分被比色皿的表面反射。如果入射光的強(qiáng)度為I0，吸收光的強(qiáng)度為Ia，透過光的強(qiáng)度為It，反射光的強(qiáng)度為Ir，則:I0＝Ia＋I(xiàn)t＋I(xiàn)r

（1）Lambert

定律

當(dāng)一束單色光通過濃度一定的溶液時，液層厚度愈大，光線強(qiáng)度減弱愈顯著。（2）Beer定律

當(dāng)一束單色光通過液層厚度一定的溶液時，溶液的濃度愈大，光線強(qiáng)度減弱愈顯著。

令：A=-logT，A定義為吸光度

A=-logT=ELC吸光度具有加和性。A總＝Aa+Ab+Ac+…。應(yīng)用;①進(jìn)行光度分析時，試劑或溶劑有吸收，則可由所測的總吸光度A中扣除，即以試劑或溶劑為空白的依據(jù)；②測定多組分混合物；③校正干擾。

2、吸光系數(shù)定性的依據(jù):在一定條件下（如單色光波長，溶劑一定、溫度一定等），不同物質(zhì)對同一波長的單色光，可以有不同的吸光系數(shù)。定量的依據(jù):在稀溶液的條件下，液層厚度一定時，吸光度和濃度呈線性關(guān)系，此時吸光系數(shù)是斜率，其值越大，靈敏度越高。

（1）摩爾吸光系數(shù)ε：含義：指濃度為1mol/L的溶液，在液層厚度為1cm時的吸光度。ε〉104，為強(qiáng)吸收ε102～104，為中強(qiáng)吸收ε〈102，為弱吸收（2）比吸收系數(shù)或稱為百分吸收系數(shù)，含義：指濃度為1％（w/v）的溶液，用厚度為1cm吸收池時的吸光度3、引起偏離Lambert-Beer定律的因素

（1）吸收定律本身的局限性

只有在稀溶液中才能成立（2）化學(xué)因素

溶液中的溶質(zhì)可因c的改變而有離解、締合、配位以及與溶劑間的作用等原因而發(fā)生偏離L-B定律的現(xiàn)象。（3）儀器因素（非單色光的影響）

目前各種方法所得到的入射光是具有一定波長范圍的波帶，而非單色光單色光的純度愈差，吸光物質(zhì)的濃度愈高，偏離朗伯-比耳定律的程度愈嚴(yán)重。（4）其它光學(xué)因素①散射和反射②非平行光外層電子的躍遷類型：

1、→*躍遷→*的能量差大所需能量高吸收峰在遠(yuǎn)紫外(<150nm)飽和烴（甲烷，乙烷）在UV測定中作為溶劑，如己烷、庚烷、環(huán)己烷等。2、n→*躍遷n軌道的能量〉成鍵軌道，吸收波長增大，一般在150～250nm間。含有雜原子團(tuán)如：-OH，-NH2，-X，-S等的有機(jī)物分子中除能產(chǎn)生→*躍遷外，同時能產(chǎn)生n→*躍遷例如：三甲基胺(CH3)3N-的n→*吸收峰在227nm，約為900L/mol·cm，屬于中強(qiáng)吸收。3、→*躍遷

→*能量差較小所需能量較低吸收峰紫外區(qū)(200nm左右)不飽和基團(tuán)（—C＝C—，—C＝O）或體系共軛，E更小，λ更大

4、n→*躍遷含有雜原子的不飽和基團(tuán)，如-C=O，-CN等的化合物，在雜原子上有未成鍵的n電子，能級較高。激發(fā)n電子躍遷到*，即n→*躍遷所需能量較小，λ200~700nm（近紫外區(qū)）

→*>n→*

→*>n→*200nm以下150～250nm200nm200～700nm

第三節(jié)有機(jī)化合物的紫外吸收光譜一、紫外吸收光譜曲線的表示方法二、紫外光譜中常用的光譜術(shù)語

1、發(fā)色團(tuán)和助色團(tuán)（1）生色團(tuán)（發(fā)色團(tuán)）：具有軌道的不飽和官能團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)有機(jī)化合物：具有不飽和鍵和未成對電子的基團(tuán)具n電子和π電子的基團(tuán)產(chǎn)生n→π*躍遷和π→π*躍遷躍遷E較低例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—注：當(dāng)出現(xiàn)幾個發(fā)色團(tuán)共軛，則幾個發(fā)色團(tuán)所產(chǎn)生的吸收帶將消失，代之出現(xiàn)新的共軛吸收帶，其波長將比單個發(fā)色團(tuán)的吸收波長長，強(qiáng)度也增強(qiáng)（2）助色團(tuán)：本身無紫外吸收，但可以使生色團(tuán)吸收峰加強(qiáng)同時使吸收峰長移的基團(tuán)有機(jī)物：連有雜原子的基團(tuán)例：—OH，—OR，—NH2，—NR2—，—X當(dāng)這些基團(tuán)單獨(dú)存在時一般不吸收紫外-可見區(qū)的光輻射。但當(dāng)它們與具有軌道的生色基團(tuán)相結(jié)合時，將使生色團(tuán)的吸收波長長移（紅移），且使吸收強(qiáng)度增強(qiáng)（助色團(tuán)至少要有一對與生色團(tuán)電子作用的孤對電子）2、紅移和藍(lán)移由于化合物結(jié)構(gòu)變化（共軛、引入助色團(tuán)取代基）或采用不同溶劑后

吸收峰位置向長波方向的移動，叫紅移（長移）

吸收峰位置向短波方向移動，叫藍(lán)移（紫移，短移）3、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)

增色效應(yīng)：吸收強(qiáng)度增強(qiáng)的效應(yīng)減色效應(yīng)：吸收強(qiáng)度減小的效應(yīng)

4、吸收帶（1）R帶：由含雜原子的不飽和基團(tuán)的n→π*躍遷產(chǎn)生C＝O；C＝N；—N＝N—E小，λmax250～400nm，εmax<100溶劑極性↑，λmax↓→藍(lán)移（短移）（2)K帶：由共軛雙鍵的π→π*躍遷產(chǎn)生(—CH＝CH—)n—CH＝C—CO—λmax>200nm，εmax>104共軛體系增長，λmax↑→紅移，εmax↑溶劑極性↑，對于—(—CH＝CH—)n—λmax不變對于—CH＝C—CO—λmax↑→紅移3．B帶：由π→π*躍遷和苯環(huán)的振動的重疊引起的產(chǎn)生芳香族化合物的主要特征吸收帶λmax=254nm，寬帶，具有精細(xì)結(jié)構(gòu)；εmax=200極性溶劑中，或苯環(huán)連有取代基，其精細(xì)結(jié)構(gòu)消失4．E帶：由苯環(huán)環(huán)形共軛系統(tǒng)的π→π*躍遷產(chǎn)生芳香族化合物的特征吸收帶E1180nmεmax>104（常觀察不到）E2200nmεmax=7000強(qiáng)吸收苯環(huán)有發(fā)色團(tuán)取代且與苯環(huán)共軛時，E2帶與K帶合并一起紅移（長移）有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)與紫外信息的關(guān)系（1）200-400nm無吸收峰。飽和化合物，單烯。（2）270-350nm有吸收峰（ε=10-100）醛酮n→π*躍遷產(chǎn)生的R帶。（3）250-300nm有中等強(qiáng)度的吸收峰（ε=200-2000），芳環(huán)的特征吸收（具有精細(xì)解構(gòu)的B帶）。（4）200-250nm有強(qiáng)吸收峰（ε104），表明含有一個共軛體系（K）帶。

不飽和醛酮：K帶230nm，R帶310-330nm260nm,300nm,330nm有強(qiáng)吸收峰，3,4,5個雙鍵的共軛體系。第四節(jié)影響紫外光譜的因素

1．溶劑效應(yīng)：對λmax影響：n-π*躍遷：溶劑極性↑，λmax↓藍(lán)移π-π*躍遷：溶劑極性↑，λmax↑紅移對吸收光譜精細(xì)結(jié)構(gòu)影響

溶劑極性↑，苯環(huán)精細(xì)結(jié)構(gòu)消失溶劑的選擇——極性；純度高；截止波長<λmax2．pH值的影響：影響物質(zhì)存在形式，影響吸收波長例：苯胺，以乙醇作溶劑，λmax為230nm以稀酸作溶劑，λmax為203nm利用溶劑pH值不同對光譜的影響，可以測定化合物結(jié)構(gòu)中的酸性或堿性基團(tuán)

3、超共軛效應(yīng)在共軛體系中，如果存在烷基取代，則烷基的C-H鍵的σ電子和共軛體系的π電子會產(chǎn)生重疊，使電子活動范圍擴(kuò)大，躍遷能量降低，吸收峰波長向長波長方向移動，這種作用為超共軛效應(yīng)。4、助色效應(yīng)助色團(tuán)和某些生色團(tuán)相連時，使吸收波長λmax紅移，吸收強(qiáng)度增大，這種效應(yīng)稱為助色效應(yīng)。第五節(jié)紫外－可見分光光度計

一、光源：提供入射光的裝置光源的發(fā)光面積應(yīng)該小，同時應(yīng)附有聚光鏡把光聚集在單色器的進(jìn)光狹縫。1、鎢燈:作為可見光源，適用范圍為350～1000nm2、氫燈或氘燈作為紫外光源，是一種氣體放電發(fā)光的光源，發(fā)射200～400nm的連續(xù)光譜，二、單色器：包括狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件1、色散元件功能：把混合光分散為單色光的元件棱鏡——對不同波長的光折射率不同分出光波長不等距色散元件長區(qū)密，短區(qū)疏光柵——衍射和干涉分出光波長等距2、準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直鏡是以狹縫為焦點(diǎn)的聚光鏡。3、狹縫入口狹縫：限制雜散光進(jìn)入出口狹縫：使色散后所需波長的光通過。狹縫的寬度對分光質(zhì)量影響：狹縫過寬，單色光不純；狹縫太窄，則光通量小，靈敏度降低

三、吸收池：玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)石英——不能吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)要求：匹配性（對光的吸收和反射應(yīng)一致）四、檢測器：將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕难b置光電換能器，是把所接受到的光信號轉(zhuǎn)變成電信號的元件

常用的有：光電管和光電倍增管1、光電管90VDC直流放大陰極R-+光束e陽極絲（Ni）抽真空陰極表面可涂漬不同光敏物質(zhì)產(chǎn)生的光電流約為硒光電池的1/10。優(yōu)點(diǎn)：阻抗大，電流易放大；響應(yīng)快；應(yīng)用廣。缺點(diǎn)：有微小暗電流（Darkcurrent，40K的放射線激發(fā)）。900Vdc90V123456789陽極陰極石英封讀出裝置R光電倍增管（PMT）電路圖優(yōu)點(diǎn)：高靈敏度；響應(yīng)快；適于弱光測定，甚至對單一光子均可響應(yīng)。缺點(diǎn)：熱發(fā)射強(qiáng)，因此暗電流大，需冷卻（-30oC)。不得置于強(qiáng)光(如日光)下，否則可永久損壞PMT！2、光電倍增管五、顯示器光電管輸出的光電流很小，需要經(jīng)過放大后才能以某種方式將測定結(jié)果顯示出來。常用的顯示裝置有:檢流計、曲線掃描、熒光屏顯示等，數(shù)據(jù)工作站。電表指針、數(shù)字顯示、熒光屏顯示等；顯示方式：A、T(%)、c等

第六節(jié)紫外吸收光譜的應(yīng)用

一、定性分析吸收光譜的形狀吸收峰的數(shù)目吸收峰的位置（波長）吸收峰的強(qiáng)度相應(yīng)的吸光系數(shù)定性鑒別的依據(jù)－吸收光譜的特征(一）比較吸收光譜法根據(jù)化合物吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目、強(qiáng)度、位置進(jìn)行定性分析待測樣品相同條件樣品譜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)譜（二）計算max的經(jīng)驗規(guī)律二、有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)的推斷1.推測官能團(tuán)200～280nm無吸收不含不飽和鍵，不含苯環(huán)，可能是飽和化合物210～250nm強(qiáng)吸收ππ*，2個共軛單位

260～350nm強(qiáng)吸收ππ*，3—5個共軛單位

270～350nm弱吸收nπ*，無強(qiáng)吸收，孤立含雜原子的雙鍵C=O,-NO2,-N=N-

260nm（230～270）中吸收ππ*，有苯環(huán)2、異構(gòu)體的判斷（1）順反異構(gòu)體的判斷生色團(tuán)和助色團(tuán)處在同一平面上時，才產(chǎn)生最大的共軛效應(yīng)。由于反式異構(gòu)體的空間位阻效應(yīng)小，分子的平面性能較好，共軛效應(yīng)強(qiáng)。因此，反式異構(gòu)體的吸收峰波長及強(qiáng)度都大于順式異構(gòu)體的吸收峰波長及強(qiáng)度。順式280nm13500反式295nm27000肉桂酸(2)互變異構(gòu)體的判斷例如：乙酰乙酸乙酯就是酮式和烯醇式兩種互變異構(gòu)體：酮式異構(gòu)體沒有共軛體系，在近紫外光區(qū)沒有強(qiáng)吸收，只是在為272nm(ε為16)處有弱吸收，是n－π*躍遷所產(chǎn)生R吸收帶。烯醇式異構(gòu)體有共軛體系，所以在近紫外有強(qiáng)吸收，為243nm(ε為16000)，是π－π*躍遷共軛體系的K吸收帶。兩種異構(gòu)體的互變平衡與溶劑有密切關(guān)系

在極性溶劑如水中在非極性溶劑如乙烷中，由于形成分子內(nèi)的氫鍵

三、定量分析應(yīng)用范圍：無機(jī)化合物，測定主要在可見光區(qū)，大約可測定50多種元素有機(jī)化合物，主要在紫外區(qū)1.單組分物質(zhì)的定量分析測定條件：選擇合適的分析波長（λmax）A：0.2～0.8選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤海?）比較法：在一定條件下，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，在λmax下測A

標(biāo)準(zhǔn)溶液As=κCsL

被測溶液Ax=κCxL

Cx=CsAx/As

注意：Cs與Cx大致相當(dāng)（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法AλCXAX配制一系列（5～10）個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在適當(dāng)

——通常為max下，以適當(dāng)?shù)目瞻兹芤鹤鲄⒈?，分別測定A，然后作A-c曲線。同條件下測定試樣溶液吸光度Ax，查找對應(yīng)的cx

。2.多組分物質(zhì)的定量分析（只討論2組分）在某特定波長下測定A總=A1+A2+A3+……吸光度加和性（1）吸收光譜互不重疊在1處測a組分，b組分不干擾在2處測b組分，a組分不干擾(2)第二種情況:部分重疊在1處a、b組分都吸收在2處b組分吸收，a組分不干擾A1a+b=A1a+A1b

A2b=E2

bCbLab1

2（3）第三種情況:兩吸收曲線互相重疊第一法：解方程組選定兩個波長1及2，測得試液的吸光度為A1和A2，則可解方程組求得組分a、b的濃度ca、cb：在1處：

在2處第二法：等吸光度雙波長（消去）法找等吸收度點(diǎn)四、光度法顯色反應(yīng)條件和測量條件的選擇（一）影響顯色反應(yīng)的因素及反應(yīng)條件的選擇1、顯色反應(yīng)的選擇（1）選擇性好：干擾少或易排除；（2）靈敏度高（S）：尤其是對低含量組分，一般選擇：104～105L/mol·cm（3）有色化合物穩(wěn)定、組成恒定（4）有色化合物與顯色劑的顏色差別大

2、影響顯色反應(yīng)的因素及反應(yīng)條件(1)顯色劑的用量被測物質(zhì)與顯色劑的反應(yīng)可用下列一般式表示：M十R＝MR（被測物）（顯色劑）（有色配合物）為了使顯色反應(yīng)盡可能完全，一般應(yīng)加入過量的顯色劑。如果配合物穩(wěn)定度高，而且在一定條件下能保持穩(wěn)定，顯色劑不必大量過量。在分析實踐中，由于待測物質(zhì)的濃度未知，稍過量的顯色劑是必要的。(2)溶液的酸度①酸度對顯色劑濃度的影響

所用的顯色劑不少是有機(jī)弱酸（以HR表示），酸度提高則平衡傾向于生成HR，使R的實際濃度降低，不利于顯色反應(yīng)的進(jìn)行。因此。顯色時溶液的酸度不能高于某一限度。此外，在不同的酸度下，R的濃度不同，有時可引起有色配合物配位數(shù)的改變。

②酸度對被測離子形態(tài)的影響

當(dāng)被測離子是容易水解的金屬離子時，若酸度低于某一限度，被測離子形成羥基配合物、多核羥基配合物、堿式鹽或氫氧化物沉淀，不利于光度分析。③對顯色劑顏色的影響許多有機(jī)顯色劑具有酸堿指示劑的性質(zhì)，隨著pH的改變，顯出不同的顏色，在選擇酸度時必須考慮這種情況。例如H2RH++HRH＋R2-（黃色）（橙色）（紅色）pH6.9pH12.4(3)顯色時間

有些顯色反應(yīng)能瞬間完成，且有色化合物的顏色很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，在較長時間內(nèi)保持不變有些顯色反應(yīng)雖能迅速完成，但由于空氣的氧化、光的照射或其他原因使有色化合物的顏色逐漸減退有些顯色反應(yīng)需要一定時間才能完成

(4)顯色溫度①對顯色反應(yīng)速度的影響。反應(yīng)速度常隨溫度的升高而加快。②由于溫度的升高可能導(dǎo)致某些有色配合物發(fā)生分解或氧化還原反應(yīng)，因而會使有色配合物破壞而不利于光度測定。

③溫度升高會引起有色配合物離解度的增大，使其穩(wěn)定性降低而導(dǎo)致吸光度下降。④溫度變化會使有色配合物的摩爾吸光系數(shù)改變，從而使吸光度發(fā)生改變。在分析實踐中，并不是每一顯色反應(yīng)都同時存在上述四個方面的影響。通過繪制吸光度一溫度曲線可以確定反應(yīng)的適宜溫度。（5）溶劑通常，水溶性有色配合物因加入適當(dāng)有機(jī)溶劑，使溶液的介電常數(shù)降低，使配合物離解度減小，或穩(wěn)定性增大。有時，可增大速度（二）分光光度法測量誤差及實驗條件的選擇

誤差可能來自光源的電壓不穩(wěn)定，光電元件靈敏度的變化和儀器刻度讀數(shù)不準(zhǔn)確等。如果測量時透光率讀數(shù)的絕對誤差是ΔT，對于同一臺儀器，它基本上是常數(shù)。但由于吸光度與透光率之間是負(fù)對數(shù)關(guān)系，在不同A值時，同樣的ΔT的讀數(shù)誤差所引起的吸光度的絕對誤差ΔA是不同的。A值越大，由ΔT引起的ΔA也越大。設(shè)當(dāng)?T=0.01時，不同T%時所對應(yīng)的?c/c可從相關(guān)表查得：當(dāng)T%=36.8%即A=0.434時，?c/c最??；當(dāng)T%在15-65%之間即A在0.2~0.8范圍內(nèi)，?c/c較小。實際測定時：可通