原代神經(jīng)元培養(yǎng)

神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)從動（鼠或小鼠等的胎新生動物的腦組織取下某一局部區(qū)域，分離細(xì)胞，培養(yǎng)在培養(yǎng)容器后不再移植，常稱為原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)。一、培養(yǎng)前準(zhǔn)備1.器和器皿器械：外科剪、鑷子、虹膜剪等、小剪刀、細(xì)鑷子和虹膜小刀等各種金屬器械如解剖器械用及時刷洗干凈酒棉球擦拭后晾干經(jīng)60℃烘干，以防生銹。由于濕熱消毒對手術(shù)器械容易可用70％酒精浸泡1時以上消毒。器皿：1)玻瓶及相應(yīng)的膠塞膠木螺旋蓋，用于分裝血清、多聚賴氨酸、解剖液、各種鹽溶液和培養(yǎng)液等。2)培瓶、蓋玻片培養(yǎng)用的蓋玻片必須不含鉛發(fā)霉可用0.2N鹽浸泡10分用蒸餾水洗2次，每次10分鐘，然后入丙酮或乙醇浸泡10分鐘，再用雙蒸水洗2次每次分，烘干待消毒。凡組織學(xué)用過的舊蓋玻片一般不用。3)移管、吸管、燒杯離心管和培養(yǎng)皿。4)塑培養(yǎng)皿（35mm料養(yǎng)板、24、96孔輔助工具：放置試管、吸管和玻璃瓶等的架子。2.培基和培養(yǎng)用液的配制1)培基質(zhì)：有多聚賴酸、牛皮膠原和鼠尾膠原。本室目前常用分子量7-140000多聚賴氨酸（Poly-L-lysine濃度為0.1mg/ml。2)平鹽溶液要以無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成平衡鹽溶液主要的不同點在于NaCl

的濃度、離子濃度及緩沖系統(tǒng)的不同，可根據(jù)實際需要選用適當(dāng)?shù)钠胶恹}溶液。3)培液：目前已有現(xiàn)的干粉出售，按說明書進(jìn)行配制即可。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)需高糖，培養(yǎng)液應(yīng)含有或加葡萄糖至6g/L目前培養(yǎng)海馬神經(jīng)元可選用無清培養(yǎng)液。4)血：有胎牛血清、牛血清和馬血清等。分裝成小瓶4℃存?zhèn)溆茫ǚ盅b前需56滅活30分5)胰白酶溶液：用于離細(xì)胞。先用少量滅菌三蒸水將胰蛋白酶粉末溶成糊狀，然后補水至2.5%濃度，蕩搖勻℃過夜，待完全溶解后用濾器過濾滅菌，并分裝成1-2ml凍存。用前以D-Hanks平衡鹽水或其他無鈣鎂離子溶液溶解稀釋至0.25%。際使用溫度一般為37℃20-30分鐘。6)解溶液：由平衡鹽無鎂離子的Puck氏緩液和蔗糖－葡萄糖溶液組成稱為。D1平鹽水NaCl8.0g0.4g、Na2HPO4.7H2O0.045g、KH2PO4、酚紅0.0012g三蒸水50ml蔗糖－葡萄糖（SG糖、葡萄糖3g三蒸水50ml（H，0.352mM25ml左右的三蒸水溶解2.35g的HEPES后，用NaOH或HCl調(diào)pH至7.3-7.4加三蒸水至28ml將D1和H三合在一并稀釋到1000ml即解剖液瓶裝成5ml后℃?zhèn)溆?。二、培養(yǎng)細(xì)胞操作1.涂培養(yǎng)基一般在細(xì)胞培養(yǎng)前1-2天將使用塑料培養(yǎng)皿35mm、96孔養(yǎng)板或消毒的蓋玻片涂上一層，置于超凈臺中備用。

2.實驗動物準(zhǔn)備動物的年齡和取材部位對培養(yǎng)細(xì)胞的成活率關(guān)系密切根據(jù)具體實驗而定大鼠海馬細(xì)胞培養(yǎng)，以18天胎或新生48小內(nèi)的大鼠為宜，而培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)與脊髓神經(jīng)元以11-13天胚胎小鼠、大腦皮層以小鼠16-21天、小腦細(xì)胞取自臨或新生動物。3.進(jìn)入培養(yǎng)室操作1)穿消毒衣，戴上口和帽子。2)安消毒的實驗用具如培養(yǎng)皿、解剖器械、玻璃吸管、培養(yǎng)板等于桌面適當(dāng)?shù)奈恢谩?)將衡鹽水、解剖溶、血清、胰蛋白酶等溶液放置于桌面上，同時準(zhǔn)備一個冰袋和污物盤。4)解動物以新生大鼠海馬組織為例大鼠投入80的酒精中分。用解剖剪斷頭，并移入玻璃器皿中，沿中間骨縫將頭骨剪開（頭骨外側(cè)下沿也剪開剝開頭骨暴露大腦半球去膜中線將大腦半球往外翻開暴露內(nèi)側(cè)面半月狀的海馬組織。用彎頭鑷子輕輕夾起，放入解剖液內(nèi)（培養(yǎng)皿可置于冰袋上數(shù)個動物均解剖后，將培養(yǎng)皿內(nèi)的海馬組織移至解剖鏡下去除血管非海馬結(jié)材干凈非常重要）后，再移至小培養(yǎng)皿中，加數(shù)滴液，并用虹剪剪碎或用虹膜刀切成小粒。5)在述海馬組織加入剖溶液和0.25%胰蛋白酶各1ml搖勻后置于37培養(yǎng)箱內(nèi)消化25-30分鐘。6)將化好的細(xì)胞碎片入2ml的心管中吸去剩余的胰蛋白酶溶液加含血清的全培養(yǎng)液2ml終胰酶作用，約分后，再更換一次全培養(yǎng)液以洗凈胰酶培養(yǎng)液份為80％DMEM％胎牛血清10％馬血清或小牛血清，胎血清有助于細(xì)胞貼壁7)用徑較小的、在火上光滑過的玻璃吸管吸取細(xì)胞團(tuán)，移入另一離心管，加培養(yǎng)液并吹打20次心管斜放胞片下沉5-10分后上層細(xì)胞溶液約1ml。

離心管中再加入培養(yǎng)液1ml上打吸取細(xì)胞第1吸取的細(xì)胞混合一起后計數(shù)。8)按需的細(xì)胞濃度接在事先準(zhǔn)備的塑料培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板中，用蓋玻片則需滴滿。接種后移入37℃的％CO2養(yǎng)箱，培養(yǎng)1天可用無血清培養(yǎng)液，1星換液2次。三、細(xì)胞識別根據(jù)細(xì)胞外形及內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)胞的識別經(jīng)細(xì)胞具有顯著的特征養(yǎng)的貼壁的神經(jīng)元突起很明顯特是樹突由粗細(xì)，有分支，突起的末端有膨大的生長錐結(jié)構(gòu)不變化；細(xì)胞體呈圓形、梭形、三角形或多角形不等，胞體較厚，具有空泡狀核，有明顯的核仁；立體感強，常見暈。培養(yǎng)細(xì)胞中可包括幾種神經(jīng)元的類型和非神經(jīng)元的背景細(xì)胞”，即成纖維細(xì)胞、室管膜細(xì)和幾種膠質(zhì)細(xì)胞。成纖維細(xì)胞貼壁最快，呈扁平狀，胞核卵園形，有并列的兩粒小核仁體兩端發(fā)出細(xì)長突起。膠質(zhì)細(xì)胞貼附在膠原上和成纖維細(xì)胞形成一層地”。神經(jīng)細(xì)胞貼壁較慢，落“地毯上長遷移和分化。培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞可按一般Nissl法色或免疫細(xì)胞化學(xué)特異性染色加以鑒別。無菌操作注意事項體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力以止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件便用設(shè)備完善的實驗室。若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)?也會導(dǎo)致污染。因而．為在一操作中為最大可能的保證無菌．每一項工作都必須做到有條不紊和完全靠。【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場培養(yǎng)室、超凈臺內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后．囚物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會?！静僮饕跋尽繜o菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%新潔爾滅拖洗地面—次拖要專用．紫外

線照射消毒30-50min，凈工作臺面每次實驗前要用75酒精擦洗。然后紫外線淌毒30min在作臺面消毒切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線毒工作臺面上用品不要過多或重疊放置．否則會遮擋射線降低消毒效果。些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同紫外線消毒。【洗手和著裝原上和外科手相同平僅做觀察不做培養(yǎng)操作時穿裝細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的潔作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩消毒衣帽?！净鹧嫦尽吭诰h(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈或煤氣燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。但要注意金器械不能在為焰中燒的時間過長防退火燒的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織以造成組織損傷吸過養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼殘在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜再時會把害物帶入營養(yǎng)液中。開啟閉有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短防止因溫度過燒死細(xì)胞外膠塞過火焰時也不能時間長以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞?！静僮鳌窟M(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機(jī)會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。為拿取方便臺面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央工作由始至終保持一定順序性織或細(xì)胞在未做處理之前勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會。吸取營養(yǎng)液PBS細(xì)胞懸液及其它各種用液時，均應(yīng)分別使

用吸管混用擴(kuò)污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染中不能面向操作野講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染作用酒精擦拭超凈臺面及雙手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方口最易污染加液時如吸管尖碰到瓶口則應(yīng)將吸管丟掉。細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞計數(shù)法是細(xì)胞學(xué)實驗的一項基本技術(shù)是了解培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀態(tài)測定培養(yǎng)基血清、藥物等物質(zhì)生物學(xué)作用的重要手段。下面介紹常用的血球計數(shù)板計數(shù)法。一、用品(1)血計數(shù)板，巴氏吸管(2)0.25％蛋白酶溶液，無血清培養(yǎng)液(3)顯鏡二、步驟(1)準(zhǔn)備計數(shù)板：用酒精清潔計數(shù)板及專用蓋玻片，然用綢布輕輕拭干。(2)制備細(xì)胞懸液用消化液分散單層培養(yǎng)細(xì)胞或直接收集懸浮培養(yǎng)細(xì)胞成單個細(xì)胞懸液要求細(xì)胞密度不低于10000個細(xì)胞胞數(shù)很少懸離心(1000rpm，2min)重懸浮于少量培養(yǎng)液中。(3)加樣：用吸管輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液，計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。(4)計數(shù)：在顯微鏡下，用物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)．細(xì)胞壓線時，只計左測和上方者，不計右側(cè)和下方者。(5)計算：將計算結(jié)果代入下式，得出計數(shù)結(jié)果：細(xì)胞數(shù)／毫升原液＝大細(xì)胞數(shù)之和／4)X104

細(xì)胞計數(shù)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即為細(xì)胞密度。