第三章微載體培養(yǎng)技術詳解演示文稿

第三章微載體培養(yǎng)技術詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點優(yōu)選第三章微載體培養(yǎng)技術目前二頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點1967年被用于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)。兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，放大容易?，F(xiàn)廣泛用于培養(yǎng)各類細胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質產(chǎn)品。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)4h，微載體間的細胞“橋聯(lián)”×200

電鏡下串在一起的肝細胞微載體×730由于肝細胞的粘附作用微載體形成“串珠”×400

脊髓灰質炎、狂犬和乙腦等疫苗目前三頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點二、微載體的商品類型第一種微載體：

VanWezel用DEAE-SephadexA50研制而來市售（國際）種類有十幾種以上：液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline目前四頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點顯微鏡下的高密度微載體目前五頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點優(yōu)良的微載體應具有的特性價廉，能重復使用。不含能毒害細胞的成分；微載體須與細胞有良好的相容性；密度應略大于培養(yǎng)基；粒徑在40～120μm范圍，生理鹽水溶脹后增大到60~250μm，粒度分布地均勻，徑差不大于20~25μm；良好的光學透明性；能在PBS中耐120~125℃、20~30min高溫滅菌；應是非剛性材料；不吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分；收獲細胞或細胞制品容易，不影響蛋白質分離純化；目前六頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點三、微載體培養(yǎng)原理與操作

1、原理：將對細胞無害的顆粒——微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。絲網(wǎng)微載體通氣的培養(yǎng)基鼓泡器攪拌葉輪微載體培養(yǎng)裝置圖目前七頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點●微載體的大?。涸龃髥挝惑w積內表面積（S/F）對細胞的生長非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在100-200μm之間。

●微載體的密度：一般為2，隨著細胞的貼附及生長，密度可逐漸增大?！裎⑤d體的表面電荷：據(jù)研究，控制細胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質。若電荷密度太低，細胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會產(chǎn)生“毒性”效應。目前八頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點細胞能否黏附，主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。細胞增殖階段：黏附貼壁、生長和擴展成單層；貼壁依賴性細胞在微載體表面上：貼附是進一步鋪展和生長的關鍵，主要是靠靜電引力和范德華力；目前九頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點Vero細胞在Cytodex-3微載體表面粘附鋪展的形貌變化目前十頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點通常做法：貼壁期采用低攪拌轉速，時攪時停；數(shù)小時后，待細胞附著于微載體表面時，維持設定的低轉速，進入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度75r/min。2、攪拌轉速：動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，無法靠提高攪拌轉速來增加接觸概率。目前十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點攪拌速率越大，制得的微球越小，聚合物濃度越大，制得的微球較大以聚己內酯（PCL）、聚左旋乳酸（PLLA）、聚乙醇酸聚乳酸共聚物（PGLA）為基質制備可生物降解微載體目前十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點3、細胞與微載體的相融性：與微載體表面理化性質有關。一般細胞在進入生理pH值時，表面帶負電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷，因靜電斥力使細胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時，則帶負電荷的細胞也能貼附。目前十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點(a)MCC細胞，未經(jīng)處理的Cytodex-3表面；(b)MCC細胞，用纖粘連蛋白處理后的Cytodex-3表面(c)Vero細胞，未經(jīng)處理的Cytodex-3表面；(d)Vero細胞，用層粘連蛋白處理的Cytodex-3表面(e)Vero細胞，用纖粘連蛋白處理的Cytodex-3表面細胞（Vero和MCC）在不同外源基質處理的（Cytodex-3）微載體上貼附目前十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點

4、細胞在微載體表面的生長的影響因素

細胞方面：細胞群體、狀態(tài)和類型。微載體方面：微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時細胞擴展快，表面多孔則擴展慢。培養(yǎng)環(huán)境中：培養(yǎng)基組成、溫度、pH、DO以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長。如果所處條件最優(yōu)，則細胞生長快；反之生長速度慢。

目前十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細胞的步驟：(1)選擇合適的微載體類型(2)浸泡水化及消毒(3)接種(4)培養(yǎng)觀察與細胞記數(shù)(5)消化(6)分離細胞(7)傳代培養(yǎng)目前十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點交聯(lián)葡聚糖為基質微載體纖維素為基質微載體蛋白質為基質微載體（變性膠原微載體:蛋黃色，表面特性好，易與細胞結合）高分子材料為基質微載體無機玻璃基質微載體

微載體基質目前十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點PCL微球表面多皺，PLLA微球表面布滿坑洞，PGLA微球表面光滑不同種類聚酯的微球表面形貌差異目前十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點多孔載體培養(yǎng)優(yōu)點:降低血清用量，增加細胞固定性。生長空間大，免受機械損傷，可以提高攪拌強度和通氣量，強化傳質；多孔載體不僅能培養(yǎng)貼壁細胞，也適合懸浮細胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)；多孔載體固定細胞過程簡單，對細胞無毒害和損傷，細胞可從長滿細胞的微載體中自動轉移到未長細胞的新載體上生長，接種方便，培養(yǎng)簡單，特別適合于反應器大規(guī)模培養(yǎng)。目前十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點多孔載體制備的材料選擇(1)生物相容性：材料對細胞必須無毒害，對貼壁細胞有良好的黏附作用；(2)機械穩(wěn)定性：微載體在長時間攪拌狀態(tài)下不破碎；同時滿足微載體清洗處理、回收利用的要求。(3)熱穩(wěn)定性：在121℃、蒸汽滅菌下不分解、不破碎、不軟化。主要考慮生物相容性、機械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性目前二十頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點5、微載體培養(yǎng)操作要點

●培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的pH與溫度水平，接種細胞（對數(shù)生長期）至終體積1/3的培養(yǎng)液中，以增加細胞與微載體接觸的機會。不同的微載體所用濃度及接種細胞密度不同，常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。

目前二十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質混合。目前二十二頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點●培養(yǎng)維持期：進行細胞計數(shù)（胞核計數(shù)）、葡萄糖測定及細胞形態(tài)鏡檢；隨著細胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率；經(jīng)過3d左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重新開始攪拌。

目前二十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點

●收獲細胞：首先排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min。然后解離收集細胞及其產(chǎn)品。目前二十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點●微載體培養(yǎng)的放大：可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進行放大。使用異倍體或原代細胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。目前二十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點細胞形態(tài)飽滿、生長良好細胞形態(tài)更加立體，輪廓清晰，細胞數(shù)量明顯增加，少量微載體上細胞幾乎長滿微載體上細胞基本長滿，細胞形態(tài)健康微載體上細胞更加致密，細胞密度達到5×106個/ml以上微載體上細胞依然良好，沒有明顯細胞脫落現(xiàn)象

Marc145細胞微載體培養(yǎng)第1天

Marc145細胞微載體培養(yǎng)第2天

Marc145細胞微載體培養(yǎng)第3天

Marc145細胞微載體培養(yǎng)第4天

Marc145細胞微載體培養(yǎng)第10天目前二十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點四、微載體培養(yǎng)優(yōu)點

●培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。

●表面積/體積大，因此單位體積培養(yǎng)液的細胞產(chǎn)率高；●把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點；

●可用簡單的顯微鏡觀察細胞在微珠表面的生長情況；●簡化了細胞生長各種環(huán)境因素的檢測和控制，重現(xiàn)性好；●培養(yǎng)基利用率較高；

●放大容易；

●細胞收獲過程不復雜；

●勞動強度小；

目前二十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點傳統(tǒng)方法——疫苗生產(chǎn)的流感病毒在雞胚內培養(yǎng)生產(chǎn)過程：對幾百萬個蛋胚逐一接種和收獲，很難自動化、勞動強度大、時間消耗多，且有污染的可能。BaxterBiomedical研究中心，奧地利如今——大規(guī)模微載體培養(yǎng)Vero細胞生產(chǎn)流感疫苗成為可能馴化Vero細胞適應在用于大規(guī)模生產(chǎn)的無血清無蛋白培養(yǎng)基內生長。中試生產(chǎn)中最終的生物反應器規(guī)模是1200升。包括工藝設計，特殊的通氣和攪拌裝置，可以進一步放大到生產(chǎn)體積為6000升。關于H1N1疫苗生產(chǎn)目前二十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點流感疫苗生產(chǎn)的大規(guī)模生產(chǎn)區(qū)域(A)細胞培養(yǎng)(B)離心分離(C)超濾、洗濾。目前二十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點Vero細胞流感疫苗生產(chǎn)圖(A)未感染的細胞(B)早期細胞病變影響(C)收獲前的晚期細胞病變大規(guī)模流感病毒生產(chǎn)中細胞病變影響圖片目前三十頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點本章講授到此，謝謝！目前三十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點何謂微載體？指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。原理：

將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)?；叵胍幌拢耗壳叭揬總數(shù)四十六頁\編于十五點

一、微囊法（microencapsulation）:

用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質及營養(yǎng)物質可自由出入半透膜；囊內是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護細胞少受損傷，故細胞生長好、密度高。第四章動物細胞的微囊化培養(yǎng)目前三十三頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點圖4－1微膠囊示意圖微膠囊膜生物大分子代謝產(chǎn)物細胞營養(yǎng)物質目前三十四頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點二、研究發(fā)展歷程1、首次報道生物活性物質的微囊化研究（1957）：

將酶、蛋白質和激素等生物活性物質包封在選擇性透過膜中，形成球狀微膠囊,稱之為“生物微膠囊”。通過微膠囊膜的選擇透過作用,使囊外大于某一分子量的物質不能擴散進入,而生物環(huán)境中的營養(yǎng)成分和囊內生物活性物質或細胞分泌的小分子產(chǎn)物可以自由出入微膠囊,從而達到免疫隔離目的。目前三十五頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點2、“人工細胞”——“人工胰腺”80年代初,Lim等人將微囊化技術與組織細胞移植相結合,制備了海藻酸鈉/聚賴氨酸(APA)微膠囊,包埋豬胰島細胞形成“人工細胞”,并移植入糖尿病大鼠體內,結果成功地調節(jié)了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能,因而被稱為“人工胰腺”。該成果較好地解決了組織細胞移植過程的免疫排斥問題,避免或減少了昂貴的免疫抑制劑的使用,為組織細胞移植治療神經(jīng)/內分泌系統(tǒng)疾病提供了新思路。目前三十六頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點3、90年代以來,醫(yī)學界開始嘗試以微膠囊作為基因重組細胞的免疫隔離和運載工具,利用重組細胞的代謝產(chǎn)物調節(jié)機體生理功能,治療相關疾病。微囊化人胰島培養(yǎng)15d微囊化小牛腎上腺嗜鉻細胞培養(yǎng)10d微囊化肝癌細胞培養(yǎng)40d目前三十七頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點4、目前，微膠囊的應用研究涉及藥物控制釋放、動植物細胞培養(yǎng)、細胞和酶的固定化以及生化物質分離等領域,已經(jīng)成為材料、化學、化工、生物和醫(yī)學等多學科領域工作者的研究熱點。

SEM下微膠囊的顯微形貌

×200LSCM下微膠囊表面形貌的照片目前三十八頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點不同放大倍數(shù)的海藻酸鈣微膠囊的SEM照片不同放大倍數(shù)的殼聚糖/海藻酸鈉微膠囊的SEM照片目前三十九頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點三、性質：曾是酶固定化技術中的一種（半透膜將酶包裹在球狀的微囊里，酶及大分子不能從微囊里透出，而小分子物質可自由通過膜）。動物細胞微囊化后，與游離細胞相比，降低了培養(yǎng)時對細胞的剪切力，同時也能提供很高的細胞密度，使得產(chǎn)物濃度增加，純度提高。動物細胞微囊化培養(yǎng)的成功為干擾素、乙肝表面抗原(HBsAg)、單克隆抗體(MAb)等的產(chǎn)生提供了廣泛應用前景。

目前四十頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點表4－1微膠囊制備材料

來源類型材料天然脂質卵磷脂、神經(jīng)鞘髓磷脂等多糖海藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂、淀粉等蛋白質明膠、白蛋白、纖維蛋白半合成纖維素類衍生物羧甲基纖維素鈉、已基纖維素、醋酸纖維素及其酯等合成可降解型乳酸/乙醇酸共聚物、聚正酯、聚內酯、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨基酸非降解型聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚苯乙烯、乙烯醋酸乙酯共聚物、聚氯乙烯等目前四十一頁\總數(shù)四十六頁\編于十五點制備方法化學法界面聚合法、乳化法、輻射化學法物理化學法相分離法、溶劑蒸發(fā)法、界面沉積法、噴霧干燥法物理法靜電沉積法、氣相沉積法、流化