第三節(jié)免疫檢測技術的基本原理

目前一頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點免疫學檢測技術的優(yōu)點高度的靈敏性高度的特異性目前二頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點免疫分析技術的應用常用的診斷技術血凝試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗膠體金免疫技術放射免疫分析技術目前三頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點凝集試驗概念：顆粒性抗原(細菌、紅細胞等)與相應抗體結(jié)合，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應。1.直接凝集反應抗原與抗體直接混合作用，出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。①玻片直接凝集法：定性試驗②試管直接凝集法：半定量試驗目前四頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點試管法半定量試驗+

玻片直接凝集試驗1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512目前五頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點2.間接凝集法先將可溶性抗原或抗體吸附在顆粒載體上(如RBC,乳膠顆粒)，再與相應抗體或抗原反應，出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。臨床常用的有間接血凝試驗、乳膠凝集試驗等。+→待檢樣品抗原吸附血球或乳膠顆粒反應凝集物目前六頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點3.間接凝集抑制試驗先將待檢抗原與已知的抗體反應，再加入用已知抗原吸附的載體顆粒，不出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。例：乳膠凝集抑制試驗檢測HCG(妊娠診斷)步驟1：將已知抗體與待檢標本混勻＋＋步驟2：加入抗原吸附的乳膠顆?；靹蚩乖饺槟z顆粒結(jié)果判斷：不凝集為陽性結(jié)果已知抗體待檢標本目前七頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點凝集反應目前八頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點2.沉淀反應

概念：可溶性抗原與相應抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物稱沉淀反應。類型：★單向免疫擴散★免疫比濁法★雙向免疫擴散★對流免疫電泳目前九頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點

單向瓊脂擴散試驗目前十頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點雙向瓊脂擴散試驗目前十一頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點

對流免疫電泳目前十二頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點測吸光度計算抗原或抗體的含量抗體抗原免疫復合物的濃度與透射光的衰減呈正相關免疫比濁法原理目前十三頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點3.中和反應如抗“O”試驗4.免疫標記技術概念：用熒光素、酶、同位素等標記抗體或抗原用以測定相應抗原或抗體的技術稱為免疫標記技術。常用方法有免疫熒光技術、酶免疫技術、放射免疫檢測技術等。特點：敏感、特異、快速，能定性、定量、定位。目前十四頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點免疫標記技術酶免疫標記技術熒光免疫分析技術放射免疫分析技術免疫金標記技術目前十五頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點酶聯(lián)免疫吸附試驗1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)目前十六頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點酶及其底物

酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應.目前十七頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點酶底物顯色反應

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

目前十八頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點2、標記方法戊二醛交聯(lián)法過碘酸鹽氧化法目前十九頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點戊二醛交聯(lián)法(一步法）抗體-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-抗體酶-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶目前二十頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點戊二醛交聯(lián)法（二步法）COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗體-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶目前二十一頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗體OOONN抗體抗體H2ON抗體NaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)目前二十二頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點標記免疫物的分離與鑒定1、分離目的：去除游離酶方法：鹽析、柱層析2、鑒定抗體活性酶活性標記物純度目前二十三頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應用親和素和生物素的ELISA

目前二十四頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點目前二十五頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原目前二十六頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點獲得待分析物的未標定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標本（抗原）形成固相抗體－抗原復合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標抗體生成抗體—待測抗原—酶標記抗體的復合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體加底物進行酶催化反應根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定目前二十七頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點

間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法目前二十八頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA-間接法)目前二十九頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標本:使相應抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關的物質(zhì)加酶標抗抗體:與固相載體上抗原抗體復合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標抗抗體加底物顯色根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定目前三十頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點（三）競爭法

此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。目前三十一頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量的酶標抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合的成分加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，計算標本中待測抗原含量目前三十二頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點對照管由于只加酶標抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應較弱。目前三十三頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測中的應用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測目前三十四頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農(nóng)藥的檢測：目前三十五頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點食源性病原菌檢測試劑盒大腸桿菌檢測沙門氏菌檢測單增李斯特菌金黃色葡萄球菌

目前三十六頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點轉(zhuǎn)基因成份的檢測：如轉(zhuǎn)基因玉米中中的cry9e蛋白轉(zhuǎn)基因大豆中的CP4EPSPS蛋白質(zhì)．肉制品的摻假檢測：以辣根過氧化物酶標記不同動物肌肉和血清球蛋A抗血清檢查牛肉、馬肉、豬肉、羊肉和駝肉檢測14種畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和馬肉等，在摻假率為1%時即可檢出食品其他檢測：目前三十七頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點熒光抗體技術的原理與方法

用熒光素標記抗原或抗體，再與標本中抗體或抗原反應，然后在熒光顯微鏡下觀察，形成的IC可散發(fā)出熒光，對標本中的抗原或抗體進行測定和定位。常用的熒光素異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)等。常用的方法直接熒光法間接熒光法目前三十八頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點免疫熒光技術目前三十九頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點免疫熒光技術——直接法Ag熒光素標記的特異性抗體組織切片目前四十頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點免疫熒光技術——間接法Ag熒光素標記的抗抗體組織切片待測抗體目前四十一頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點免疫熒光技術目前四十二頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點熒光顯微鏡目前四十三頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點熒光顯微鏡使用原理激發(fā)濾片（BG）吸收濾片（OG）標本FITC吸收光峰值：490-495nmFITC發(fā)射光峰值：520-530nmBG：325-500OG：410-650目前四十四頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點免疫金標記技術免疫金標記技術(Immunogoldlabellingtechique)

主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）。目前四十五頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點一、膠體金制備

膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠（goldsolution）。目前四十六頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點

膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（nm)（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙紅色522411.00紅色52571.50.70紫色535*還原100ml0.01%HAuCl4所需量目前四十七頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點膠體金（ColloidalGold）

15~60nm優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)目前四十八頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點膠體金結(jié)合物（Conjugate）目前四十九頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點一、免疫滲濾測定(IFA)目前五十頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點

斑點滲漏法

其原理與層析法相類同，中心圓點為一株單抗，邊上小點為抗鼠二抗。先將待測樣品滴在其中，若有抗原即被結(jié)合在中心圓點，洗去未結(jié)合抗原，再滴加金標另一株單抗，若有抗原則形成金-Ab-Ag?薄膜的紅色斑點，而邊上是金-Ab-Ab2?薄膜的質(zhì)控點，是為金標二步法。

目前五十一頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點IFA——雙抗體夾心法測抗原AB目前五十二頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點IFA——結(jié)果判斷目前五十三頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點二、免疫層析測定（ICA）目前五十四頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點層析法將金標的一株單抗吸附于下端的玻璃纖維紙上，浸入尿液，此金標單抗即被溶解，并隨尿液上行，若尿中有相應抗原，既形成Ag-Ab-金復合物，當上行至中段醋酸纖維薄膜，即與下端的另一株單抗結(jié)合并被固定下來，顯示陽性結(jié)果。其上方還有一條抗鼠二抗，待紅色金標單抗上行此處即被固定下來，作為金標單抗質(zhì)控的提示。此種方法稱金標一步法。目前五十五頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點

兔抗鼠IgG鼠抗HCG單抗金標鼠抗HCG單抗尿液浸濕標志線手持端斑點金免疫層析試驗（一）目前五十六頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點斑點金免疫層析試驗（二）尿樣陽性弱陽性陰性無效質(zhì)控線測試線目前五十七頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點

ICA——雙抗體夾心法測抗原目前五十八頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點ICA---競爭法測抗原免疫層析試驗競爭法測小分子抗原原理圖目前五十九頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點ICA竟爭法結(jié)果觀察

陰性陽性無效目前六十頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點ICA——間接法測抗體目前六十一頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點ICA結(jié)果觀察

陽性陰性無效目前六十二頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個月室溫一年操作步驟3~51觀察時間3min3~20min陽性反應顏色濃度操作結(jié)束顏色不變顏色逐漸加深目前六十三頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）目前六十四頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點1、羅立新,繆瓏,潘力,等.快速檢測產(chǎn)單核李斯特菌免疫膠體金層析法的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2006,16(2):154-156.2、賴衛(wèi)華,熊勇華,陳高明,等.應用膠體金試紙條快速檢測赭曲霉毒素A的研究[J].食品科學,2005,26(5):204-207.目前六十五頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點3、諶志強,段惠莉,王新為,等.大腸埃希菌O157:H7的膠體金免疫滲濾法檢測[J].中國公共衛(wèi)生,2005,21(4):705-706.4、謝昭聰,宋志強,呂敬章,等.應用膠體金免疫層析法檢測水產(chǎn)品中霍亂弧菌的研究[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2005,28(3):163-165.目前六十六頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點5、王中民,李君文,王新為,等.免疫金滲濾試驗檢測食品中沙門氏菌的研究[J].微生物學免疫學進展,2001,29(4):45-47.6、劉永德,汪毅,陳禹雷,免疫金探針快速檢測禽流感病毒研究[J].上海交通大學學報:農(nóng)業(yè)科學版,2005,23(3):321-324.目前六十七頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點斑點金免疫滲濾試驗ADCB陰性（未懷孕）陽性（懷孕）加尿樣除去濾器加膠體金標記抗體加洗滌液結(jié)果判定目前六十八頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點免疫印跡法圖解SDS裂解病毒聚丙酰胺凝膠電泳-+95684512KD電轉(zhuǎn)印至NC膜上置待測血清中，漂洗；加酶標抗抗體，漂洗；加底物顯色1204124KD目前六十九頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點

第四節(jié)放射性核素標記技術一、常用標記方法二、標記免疫物的分離與純化目前七十頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點R：放射性核素示蹤高靈敏不直接探測待測物，而探測待測物上的標記信號(標記物的放大效應)I：免疫學反應高特異廢除以往沿用的無機或有機試劑，代之以抗體為結(jié)合劑目前七十一頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點常用標記方法1、常用放射性核素2、125I的標記方法直接法（氯胺T法）間接法（連接法）目前七十二頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點直接法（氯胺T法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I4。C125I氯胺T目前七十三頁\總數(shù)八十四頁\編于十六點間接法（連接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP目前七十四頁\總數(shù)八十四頁\