原代腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)

原代腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簭男迈r人體標(biāo)本中分離腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)器材：新鮮人體乳腺癌組織膠原酶（Ⅰ、Ⅳ型膠原酶干粉溶解于DF12培養(yǎng)基，濃度1mg/ml），DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，PBS，雙抗（青鏈霉素，100×）手術(shù)器械，培養(yǎng)皿，培養(yǎng)瓶，離心管，恒溫?fù)u床，離心機(jī)，倒置顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)原理：酶消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶。胰蛋白酶是一種胰臟制品，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水解而使細(xì)胞分散開，適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，如

乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，對(duì)細(xì)胞本身影響不大，可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。本實(shí)驗(yàn)就使用Ⅰ、Ⅳ型膠原酶對(duì)乳腺癌組織進(jìn)行消化，以獲取原代乳腺癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)步驟：將新鮮乳腺癌組織置于培養(yǎng)皿中，加入適量ＰＢＳ，使用眼科鑷和眼科剪去除組織上的血液（血塊）、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，保留腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，并用ＰＢＳ清洗兩遍。將癌組織放入新的培養(yǎng)皿中，加入少量DMEM培養(yǎng)基，使用眼科剪將組織剪成約1mm3大小的碎塊。轉(zhuǎn)入15ml離心管中，用PBS沖洗數(shù)遍，組織塊自動(dòng)下沉后，除去PBS。將組織塊轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，加入5ml膠原酶和雙抗（稀釋至2×），吹散組織碎塊，置于３７℃恒溫?fù)u床上消化組織，調(diào)節(jié)速度150r/min，每隔30min待組織塊鏡下透光性良好，呈絮狀時(shí)，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，1300r/min離心5min，棄上清。加入PBS洗滌數(shù)次，反復(fù)吹打后，1300r/min離心5min，棄上清。加入DMEM完全培養(yǎng)基（含1×雙抗），反復(fù)吹打，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，鏡下可見單個(gè)細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。注意事項(xiàng)：全程嚴(yán)格無菌操作。取材要注意新鮮和保鮮。取材和原代細(xì)胞制作時(shí)，要用鋒利的器械，盡可能減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷，切碎組織時(shí)應(yīng)避免組織干燥。若組織在消化時(shí)間較長時(shí)仍未散開，可采用多次提取消化法以減少酶對(duì)已消化下來的細(xì)胞的損傷。活細(xì)胞工作站分析技術(shù)一、本顯微鏡主要觀察方法簡介明場(chǎng)：適合常規(guī)鏡檢、病理、染色樣品的觀察方法。此觀察方法優(yōu)點(diǎn)是視野亮度高、均勻，應(yīng)用范圍廣，操作簡單。缺點(diǎn)是：透明標(biāo)本對(duì)比度低，標(biāo)本沒有立體感。相差：利用被檢物體的光程（折射率x厚度）差進(jìn)行鏡檢，即利用干涉現(xiàn)象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹?。鑒定活體細(xì)胞最實(shí)用、最經(jīng)濟(jì)的方法。熒光：物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。熒光顯微鏡利用熒光光源激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)，檢測(cè)激發(fā)光的情況以上各種觀察方法配合活細(xì)胞孵育裝置，即可完成對(duì)活細(xì)胞的各種觀察要求。活細(xì)胞孵育裝置通過軟件或TFT觸摸屏中Incubation模塊進(jìn)行精細(xì)的調(diào)節(jié)。二、系統(tǒng)開關(guān)機(jī)開機(jī)順序打開顯微鏡電源總開關(guān)打開顯微鏡開關(guān)拍熒光時(shí)打開熒光光源打開電腦及軟件關(guān)機(jī)順序先關(guān)軟件，然后是熒光光源、顯微鏡開關(guān)、電源開關(guān)??！三、明場(chǎng)觀察成像操作流程1.開總電源,顯微鏡開關(guān)(“ON/OFF”)孵育裝置及電腦2.打開鹵素?zé)舻墓忾l“TL”使光線透過聚光鏡穿透樣品3.調(diào)節(jié)光強(qiáng)，光路100%轉(zhuǎn)到眼睛4.聚光鏡打到H位5.反射鏡轉(zhuǎn)輪打到BF明場(chǎng)位置6.低倍（如10X倍）下觀察樣品，通過X/Y拉桿移動(dòng)載物臺(tái)至目標(biāo)位置，并通過粗細(xì)調(diào)焦旋鈕聚焦，然后再調(diào)至高倍7.準(zhǔn)備拍照了，首先光路切換至相機(jī)8.打開軟件，點(diǎn)開Live按鈕9.先曝光Exposure——對(duì)照Live結(jié)果進(jìn)一步精細(xì)聚焦——調(diào)節(jié)曝光時(shí)間——如果彩色模式拍照需要做自動(dòng)或互動(dòng)式白平衡（Whitebalance，Interactive）——再次曝光后——Snap成像——保存Save10.拍照完畢，先關(guān)軟件，再關(guān)顯微鏡，孵育裝置及電腦四、相差觀察成像操作流程1.開總電源,顯微鏡開關(guān)(“ON/OFF”)孵育裝置及電腦無菌操作。Western操作步驟收集細(xì)胞，加入100μl裂解液和1μl蛋白酶抑制劑（比例100:1），置于冰上30min；4℃離心，15000rpm，15min吸上清液于新EP管中（約60~80μl）；按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明測(cè)蛋白質(zhì)濃度；加入電泳加樣緩沖液（與吸取的上清比例為1:4），煮沸10min，緩慢恢復(fù)室溫后，稍離心，可置于-20℃制備凝膠：將洗凈且干燥的兩塊玻璃板底端對(duì)齊后安放在灌膠支架上，參照分離膠配制體系依次加入各個(gè)組分，混勻。將配置好的凝膠，沿玻璃板的一角小心緩慢注入，防止產(chǎn)生氣泡。根據(jù)梳子深度確定灌制高度，通常距離矮板至少2cm，灌好后，注入酒精或水封膠。此時(shí)可按照配方配制5%濃縮膠，注意TEMED在灌膠前再加入。靜置一段時(shí)間待凝膠聚合（約30min）。凝膠聚合后，棄去封膠溶液，并用吸水紙吸干。往濃縮膠里加入適量TEMED，混勻后緩慢灌入到膠槽至矮板頂部，插上梳子，操作時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。靜置一段時(shí)間（約30min）至凝膠聚合。8、上樣及電泳：安裝電泳槽，注意確保內(nèi)槽不漏緩沖液，往電泳槽加入足量電泳緩沖液，緩沖液要淹沒過玻璃板和凝膠。吸取適量樣品和分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，緩慢加入至膠孔。注意：加樣太快會(huì)使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出；加入下一個(gè)樣品時(shí)，要注意更換槍頭，以免交叉污染。上樣完畢后，蓋上電泳槽蓋子，接通電源，設(shè)置電泳條件，恒壓100-120V（可以先80V，待跑過濃縮膠后加至100V或以上）。電泳至溴酚蘭剛跑出即可關(guān)閉電泳儀停止電泳。9、轉(zhuǎn)膜：將玻璃板從電泳槽中取出，用塑料切膠器在玻璃板的兩邊輕輕撬動(dòng)，至到小玻璃板開始松動(dòng)。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，注意不要把分離膠刮破。PVDF膜預(yù)先用甲醇浸泡5min，然后將轉(zhuǎn)印膜、印跡濾紙和海綿墊浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中10min。膜和印跡濾紙的大小應(yīng)裁剪至與膠的大小相當(dāng)。在黑色面板上放置一層海綿墊，并依次放置至少3層印跡濾紙、凝膠、轉(zhuǎn)印膜和至少3層印跡濾紙。放置膜時(shí)盡量一次性準(zhǔn)確放置，凝膠與轉(zhuǎn)印膜一旦接觸就不要再移動(dòng)，并記住膜與膠的接觸面。玻璃試管輕輕滾壓濾紙擠出氣泡，并用海綿覆蓋。關(guān)上轉(zhuǎn)印夾，合上鎖扣。安裝好的轉(zhuǎn)印夾應(yīng)該使膠緊密地與PVDF膜接觸而不被擠壓。將組裝好的夾子裝入轉(zhuǎn)移電泳槽中，要使夾子的黑面對(duì)槽的黑面。添加電轉(zhuǎn)緩沖液，蓋好蓋子，開啟并設(shè)置電轉(zhuǎn)條件，一般用150mA1-2h。注意：電泳轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，需要在電泳槽的一邊放一些冰來降溫。免疫反應(yīng)：印跡后的PVDF膜用5%脫脂奶粉溶液室溫孵育封閉2h，將抗體用一抗稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度，室溫下孵育PVDF膜過夜。用PBST在室溫下?lián)u床上洗3次，每次15min。將過氧化物酶標(biāo)記的二抗按照適當(dāng)比例用PBST稀釋(二抗的種屬應(yīng)和一抗一致)，室溫下孵育PVDF膜2h。用PBST于室溫下?lián)u床上洗3次，每次15min。12、ECL化學(xué)發(fā)光與X光片定影：加入顯色底物后按常規(guī)X光片顯影方法將轉(zhuǎn)印膜上的信號(hào)轉(zhuǎn)移至X光片上。RealTimePCR操作步驟RNA抽提1.所需材料試劑：(1).TaKaRaRNAisoReagent試劑(2).氯仿(3).異丙醇

(4).75%乙醇（DEPC處理水配制）

(5).RNase-free水（制備方法：使用RNase-free的玻璃瓶，向超純水中加入DEPC至終濃度0.01%（v/v），過夜攪拌后，高溫高壓滅菌。

(6).盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應(yīng)在使用前按下列方法進(jìn)行處理。

a）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下處理12小時(shí)。

b）然后在120℃下高壓滅菌30分鐘以除去殘留的DEPC。(7).用于RNA實(shí)驗(yàn)的試劑，須使用干熱滅菌（180℃，60分鐘）或使用上述方法進(jìn)行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可以使用RNA實(shí)驗(yàn)用的一次性塑料容器），使用的無菌水須用0.1%的DEPC處理后再進(jìn)行高溫高壓滅菌。

RNARNAisoReagent的使用量情況如下

2.實(shí)驗(yàn)樣品的研磨和勻漿。

A.貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

①倒出培養(yǎng)液，用1×PBS清洗一次。

②每10cm2生長的培養(yǎng)細(xì)胞中加入2ml的RNAisoReagent，水平放置片刻，使裂解液均勻分布于

細(xì)胞表面并裂解細(xì)胞，然后使用移液槍吹打細(xì)胞使其脫落（對(duì)于貼壁牢固的培養(yǎng)細(xì)胞可用細(xì)胞刮勺剝

離細(xì)胞）。

③將內(nèi)含細(xì)胞的裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀。

④室溫靜置5分鐘。

B.懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

①將懸浮培養(yǎng)細(xì)胞連同培養(yǎng)液一起倒入離心管中，8,000g4℃離心2分鐘，棄上清。

②向每5×106個(gè)細(xì)胞中加入lml的RNAisoReagent。

③用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀。

④室溫靜置5分鐘。

C.動(dòng)物組織、植物材料樣品

①將超低溫凍結(jié)的RNA提取樣品稱量后迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷

加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明顯的可見顆粒，如果沒有研磨徹底會(huì)影響RNA的收率和質(zhì)量）。

②對(duì)于普通的RNA提取樣品，可以向研缽中加入適量的RNAisoReagent，將研磨成粉末狀的樣品完

全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。

3.總RNA的提取。

①向上述步驟2的勻漿裂解液中加入氯仿（RNAisoReagent的1/5體積量），蓋緊離心管蓋，用力震蕩（氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，振蕩時(shí)應(yīng)小心離心管蓋突然彈開）。待充分乳化溶液呈乳白狀（無分相現(xiàn)象）后，再室溫靜置15分鐘。

②12,000g4℃離心15分鐘。

③從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，即：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中（切忌吸出白色中間層）。

④向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫靜置10分鐘。

⑤12,000g4℃離心10分鐘。一般在離心后，試管底部會(huì)出現(xiàn)沉淀。

4.RNA沉淀的清洗

小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75％的乙醇lml（切勿觸及沉淀），輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12,000g4℃離心5分鐘后小心棄去乙醇（為了更好地控制RNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇）。

5.RNA的溶解

室溫干燥沉淀2～5分鐘（不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會(huì)很難溶解，有關(guān)RNA溶解可以參考Troubleshooting中的相關(guān)說明），加入適量的RNase-free水溶解沉淀，必要時(shí)可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。6.RNA濃度測(cè)定吸取lul抽提的RNA用DEPC水稀釋10倍后．在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定RNA濃度，以DEPC水做空白對(duì)照，同時(shí)記錄RNA濃度及其逆轉(zhuǎn)錄所需準(zhǔn)備試劑：TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒036A操作步驟：按下列組份配制RT反應(yīng)液(反應(yīng)液配制請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行)試劑使用量5×PrimeScriptRTMasterMix2TotalRNA500ngRNaseFreedH2OUpto10ul反應(yīng)體系可按需求相應(yīng)放大輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下：3715min855sec4注意：得到的RT反應(yīng)液加入到下一步的RealTimePCR反應(yīng)體系中，其加入量不要超過RealTimePCR反應(yīng)體積的1/10（V/V）量。定量PCR