蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性演示文稿

蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性演示文稿目前一頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)（優(yōu)選）蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性.目前二頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)一、蛋白質(zhì)失活的機(jī)制根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次不同，經(jīng)常將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分為一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)就是共價(jià)主鏈的氨基酸序列，有時(shí)也稱化學(xué)結(jié)構(gòu)。二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)又稱空間結(jié)構(gòu)（即三維結(jié)構(gòu)）或高級(jí)結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)的生物功能決定于它的高級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)是由一級(jí)結(jié)構(gòu)即氨基酸序列決定的。而氨基酸序列是由遺傳物質(zhì)DNA的核苷酸序列決定的。肽鍵（CO-NH）是連接多肽鏈主鏈中氨基酸殘基的共價(jià)鍵，二硫鍵（-S-S-）是使多肽鏈之間交聯(lián)或使多肽鏈內(nèi)成環(huán)的共價(jià)鍵。

目前三頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)一、蛋白質(zhì)失活的機(jī)制蛋白質(zhì)不穩(wěn)定（失活）的表現(xiàn)分為兩種，即化學(xué)不穩(wěn)定和物理不穩(wěn)定?；瘜W(xué)不穩(wěn)定是指蛋白質(zhì)分子通過共價(jià)鍵的形成和斷裂形成新的化學(xué)實(shí)體；物理不穩(wěn)定指蛋白質(zhì)分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)的物理轉(zhuǎn)變，無共價(jià)鍵改變。物理不穩(wěn)定包括變性、聚集、沉淀和表面吸附。蛋白質(zhì)一旦發(fā)生了化學(xué)不穩(wěn)定，就會(huì)完全喪失其原有生理活性，產(chǎn)生新的功能活性或完全喪失生物活性。但物理不穩(wěn)定現(xiàn)象一般可以通過特定的途徑恢復(fù)其空間結(jié)構(gòu)，而恢復(fù)原有的活性，我們稱這一過程為蛋白質(zhì)的復(fù)性。目前四頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素蛋白質(zhì)的天然折疊結(jié)構(gòu)決定于3個(gè)因素：1、與溶劑分子（一般為水）的相互作用；2、溶劑的pH和離子組成；3、蛋白質(zhì)的氨基酸序列。前兩個(gè)因素的影響明確、易理解，而氨基酸序列的作用則不那么直覺。實(shí)際上,一級(jí)結(jié)構(gòu)便于序列上相鄰部分之間短程相互作用的形成，也便于相隔部分之間長程相互作用的出現(xiàn)，雖然蛋白質(zhì)分子的整個(gè)結(jié)構(gòu)出看起來像是無組織的隨機(jī)排列，然而其結(jié)構(gòu)中無例外地有多種力處于精細(xì)的平衡之中，正是它決定了蛋白質(zhì)的獨(dú)特構(gòu)象。目前五頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力主要是一些所謂的弱的相互作用或稱非共價(jià)鍵或次級(jí)鍵，包括：氫鍵、范德華力、疏水作用和鹽鍵（離子鍵）。此外，共價(jià)二硫鍵在穩(wěn)定某些蛋白質(zhì)的構(gòu)象方面也起著重要作用。這幾種作用力的鍵能（斷裂該鍵所需的能量）都是較低的。目前六頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素氫鍵13-30KJ/mol-1范德華力4-8KJ/mol-1

疏水作用12-20KJ/mol-1（注意：疏水作用的數(shù)值表示在25℃非極性側(cè)鏈能夠從蛋白質(zhì)內(nèi)部轉(zhuǎn)移到水介質(zhì)中所需的自由能，它與其他鍵的鍵能不同，此數(shù)值在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增加。實(shí)際上它并不是鍵能，此能量的大部分并不用于伸展過程中鍵的斷裂。）鹽鍵12-30KJ/mol-1二硫鍵210KJ/mol-1目前七頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素（一）氫鍵：氫鍵在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中起著極其重要的作用，多肽主鏈上的羰基和酰胺基之間形成的氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，另外，氫鍵還可以在側(cè)鏈與側(cè)鏈、側(cè)鏈與介質(zhì)水、主鏈肽基與側(cè)鏈或主鏈肽基與水之間形成。大多數(shù)蛋白質(zhì)分子所采取的折疊策略是使主鏈肽基之間形成最大數(shù)目的分子內(nèi)氫鍵（如α螺旋、β折疊），與此同時(shí)保持大多數(shù)能成氫鍵的側(cè)鏈處于蛋白質(zhì)分子的表面將與水結(jié)合。目前八頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素（二）范德華力（范德華相互作用）：廣義的范德華力包括3種較弱的作用力，即：

定向效應(yīng)：發(fā)生在極性分子或極性基團(tuán)之間，它是永久偶極間的靜電相互作用，氫鍵可被認(rèn)為屬于這種范德華力；

誘導(dǎo)效應(yīng)：發(fā)生在極性物質(zhì)與非極性物質(zhì)之間，這是永久性偶極與由它誘導(dǎo)而來的誘導(dǎo)偶極之間的靜電相互作用；

分散效應(yīng)：是在多數(shù)情況下起主要作用的范德華力，它是非極性分子或基團(tuán)間僅有的一種范德華力，即狹義的范德華力，通常所說的范德華力指的就是這種作用力。它是瞬時(shí)偶極間的相互作用，偶極方向是瞬時(shí)變化的。目前九頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素

瞬時(shí)偶極是由于所在分子或基團(tuán)中電子電荷密度的波動(dòng)，即電子運(yùn)動(dòng)的不對(duì)稱性造成的。瞬時(shí)偶極可以誘導(dǎo)周圍的分子或基團(tuán)產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極，誘導(dǎo)偶極反過來又穩(wěn)定了原來的偶極，因此它們之間產(chǎn)生了相互作用。狹義的范德華力是一種很弱的作用力，而且隨非共價(jià)鍵合原子與分子間距離（R）的6次方的倒數(shù)而變化。雖然就個(gè)別來說，范德華力是很弱的，但是范德華相互作用數(shù)量大，并且具有加和效應(yīng)和位相效應(yīng)（當(dāng)分子或集團(tuán)相同時(shí)，其瞬間偶極矩同位相，從而產(chǎn)生最大的相互作用），因此，就成為一種不可忽視的作用力。目前十頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素（三）疏水作用：水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是趨向于把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部，這一現(xiàn)象稱為疏水作用或疏水效應(yīng)。它在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)方面占有突出地位。疏水作用其實(shí)并不是疏水基團(tuán)之間有什么吸引力的緣故，而是疏水基團(tuán)或疏水側(cè)鏈出自避開水的需要而被迫接近。當(dāng)然，當(dāng)疏水基團(tuán)接近到等于范德華距離時(shí)，相互間將有弱的范德華引力，但這不是主要的。蛋白質(zhì)溶液中的熵增加是疏水作用的主要?jiǎng)恿?。疏水作用在生理溫度范圍?nèi)隨溫度升高而加強(qiáng)，但超過一定溫度后（50-60℃，因側(cè)鏈而異），又趨減弱，因?yàn)槌^這個(gè)溫度，疏水基團(tuán)周圍的水分子有序度降低，因而有利于疏水基團(tuán)進(jìn)入水中。非極性溶劑、去污劑是破壞疏水作用的試劑，因此是變性劑。尿素和鹽酸胍既能破壞氫鍵，又能破壞疏水作用，因此是強(qiáng)變性劑。目前十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素（四）鹽鍵：又稱鹽橋或離子鍵。它是正電荷與負(fù)電荷之間的一種靜電相互作用。在生理pH下,蛋白質(zhì)中的酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）的側(cè)鏈可離解成負(fù)離子，堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸和組氨酸）的側(cè)鏈可離解成正離子。在多數(shù)情況下這些基團(tuán)都分布在球狀蛋白質(zhì)分子表面，而與介質(zhì)水分子發(fā)生電荷-偶極之間的相互作用，形成排列有序的水化層，這對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象有著一定作用。帶電荷的側(cè)鏈也在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部出現(xiàn)，它們一般與其他基團(tuán)形成強(qiáng)的氫鍵，但是偶爾也有少數(shù)帶相反電荷的側(cè)鏈在分子的疏水作用內(nèi)部形成鹽鍵。在疏水環(huán)境中，介電常數(shù)比在水中低，相反電荷間的吸引力相應(yīng)增大。當(dāng)荷電側(cè)鏈從水中轉(zhuǎn)移到分子內(nèi)部時(shí)，它周圍有序排列的水分子被釋放到介質(zhì)水中，因此，鹽鍵的形成不僅是靜電吸引而且也是熵增加的過程。升高溫度，可以增加鹽橋的穩(wěn)定性。此外，鹽鍵因加入非極性溶劑而加強(qiáng)，加入鹽類而減弱。目前十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中影響穩(wěn)定性的重要因素（五）二硫鍵：二硫鍵的形成并不規(guī)定多肽鏈的折疊。然而一旦蛋白質(zhì)采取了它的三維結(jié)構(gòu)，則二硫鍵的形成將對(duì)此構(gòu)象起穩(wěn)定作用。同一個(gè)蛋白質(zhì)中，有些二硫鍵是生物活性所必需的，另一些二硫鍵則不是生物活性所必需的，但與維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有關(guān)，假如蛋白質(zhì)中所有的二硫鍵相繼被還原，將引起蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象改變和生物活性丟失。目前十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)三、環(huán)境因素對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響物理因素：溫度、紫外線照射、高壓和表面張力等；化學(xué)因素：有機(jī)溶劑、脲、胍、酸、堿等；如尿素和鹽酸胍，一方面能與多肽主鏈競爭氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；更重要的是它們可以增加非極性側(cè)鏈在水中的溶解度，因而降低了維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的疏水相互作用。酶的作用：一些蛋白質(zhì)分解酶類的作用。微生物因素：微生物分解利用蛋白質(zhì)進(jìn)行生長繁殖目前十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)三、環(huán)境因素對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響值得注意的是：蛋白質(zhì)的變性是一個(gè)協(xié)同過程，它是在所加變性劑的很窄濃度范圍內(nèi)或很窄pH或溫度間隔內(nèi)突然發(fā)生的。目前十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)四、分離純化中保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定的方法

1、盡量在相對(duì)密封和無菌的環(huán)境下快速進(jìn)行分離純化操作；2、在生理溫度和壓力范圍內(nèi)完成分離純化操作；3、慎用溶劑和酸、堿、鹽類，使用前要進(jìn)行詳細(xì)的試驗(yàn)，確定最佳添加量和條件；4、鈍化或抑制蛋白質(zhì)分解酶類的活性；5、選擇合適分離方法。如：凝膠過濾、離子交換、吸附層析、親和層析、電泳、結(jié)晶等。目前十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)五、包含體的形成與性質(zhì)重組蛋白質(zhì)的過量表達(dá)常常導(dǎo)致其在胞內(nèi)發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集，形成被稱為包含體的集聚體。包含體主要是由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部分是基因表達(dá)產(chǎn)物。這些基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒有生理活性。對(duì)于以包含體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)，需要在分離回收包含體后，溶解包含體使其肽鏈伸展，然后在合適的溶液環(huán)境下使目標(biāo)蛋白質(zhì)恢復(fù)天然構(gòu)型和生物活性，這一過程稱為蛋白質(zhì)的體外再折疊或復(fù)性。目前十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)五、包含體的形成與性質(zhì)(一)包含體的形成目前，關(guān)于包含體的形成機(jī)理尚不完全清楚，一般認(rèn)為包含體的形成是部分折疊的中間態(tài)之間疏水性相互作用的結(jié)果。

主要原因是蛋白質(zhì)本身具有易于聚集沉淀的性質(zhì)，或表達(dá)產(chǎn)物周圍的物理環(huán)境（如溫度、離子組成）不適或某些折疊輔助因子（分子伴侶）的作用。

目前十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)五、包含體的形成與性質(zhì)現(xiàn)代研究表明：在大多數(shù)情況下，包含體的形成是蛋白質(zhì)過量表達(dá)的結(jié)果，而與蛋白質(zhì)的種類和表達(dá)系統(tǒng)無關(guān)，即包含體的形成與其相對(duì)分子質(zhì)量、疏水性以及折疊途徑等內(nèi)在性質(zhì)沒有必然的聯(lián)系。換句話說，對(duì)于任何蛋白質(zhì)和任何表達(dá)系統(tǒng)，在過量表達(dá)的情況下都可能形成包含體。蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性和包含體的形成為動(dòng)力學(xué)競爭的結(jié)果。目前十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)五、包含體的形成與性質(zhì)UkiIkrNkaA其中：U為伸展肽鏈；I為折疊過程的中間態(tài)；N為天然活性態(tài)；A為聚集體（包含體），ki、kr、ka分別為中間體生成速率常數(shù)、折疊速率常數(shù)和聚集體生成速率常數(shù)。

活性產(chǎn)物N的形成為分子內(nèi)折疊反應(yīng)，折疊速率與濃度成正比；聚集體A的形成反應(yīng)在分子間發(fā)生，反應(yīng)速率與濃度的高次方成正比，即反應(yīng)級(jí)數(shù)≥2。因此，如果新生肽濃度增加和中間態(tài)的疏水相互作用就可能導(dǎo)致包含體的形成。目前二十頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)五、包含體的形成與性質(zhì)上述分析表明，包含體的形成是不可預(yù)測(cè)的，取決于系統(tǒng)的表達(dá)速度和濃度。但當(dāng)含有二硫鍵的蛋白質(zhì)在細(xì)菌的胞液中表達(dá)時(shí)，由于胞液為還原性，巰基間不能被氧化形成二硫鍵而導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊，必然會(huì)形成包含體。目前二十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)五、包含體的形成與性質(zhì)（二）包含體形成的利與弊胞內(nèi)重組蛋白質(zhì)包含體的沉積可能是“天堂”，也可能是“地獄”。至于是“天堂”還是“地獄”，主要取決于沉積的包含體蛋白質(zhì)是否容易復(fù)性。1、包含體的體內(nèi)抑制對(duì)于那些難于復(fù)性的蛋白質(zhì)（如相對(duì)分子量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜和含有較多二硫鍵的蛋白質(zhì)），包含體的形成意味著表達(dá)系統(tǒng)的失敗，必須著力于胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)表達(dá)的研究，避免包含體的形成，提高可溶性蛋白質(zhì)的表達(dá)量，即包含體的體內(nèi)抑制，主要方法有：目前二十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)五、包含體的形成與性質(zhì)（1）降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度，減緩蛋白質(zhì)的表達(dá)速度和降低表達(dá)量；（2）將目標(biāo)蛋白質(zhì)與分子伴侶蛋白、折疊酶和二硫鍵異構(gòu)酶共表達(dá)，彌補(bǔ)外源蛋白質(zhì)表達(dá)過程中缺乏的輔助因子；（3）使用非代謝性碳源，降低代謝速度和蛋白質(zhì)表達(dá)量；(4)將目標(biāo)蛋白質(zhì)與親水性蛋白質(zhì)融合表達(dá)，常用的融合蛋白質(zhì)有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白和硫氧還原蛋白。目前二十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)五、包含體的形成與性質(zhì)

2．以包含體形式表達(dá)重組蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)（1）包含體蛋白質(zhì)主要在以大腸桿菌為宿主細(xì)胞的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中形成，而大腸桿菌生長速度快，易于高密度培養(yǎng)，有利于大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)；（2）包含體是在過量表達(dá)的情況下形成的，因此一般包含體蛋白質(zhì)的表達(dá)量都很高；（3）包含體富含目的基因表達(dá)產(chǎn)物，有利于后續(xù)的分離純化。在適宜的包含體提取和純化條件下，目標(biāo)產(chǎn)物純度可達(dá)90%以上；目前二十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)以包含體形式表達(dá)重組蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)

（4）沉積于包含體內(nèi)的目標(biāo)蛋白質(zhì)不易被蛋白酶水解；（5）對(duì)于那些對(duì)宿主細(xì)胞有毒害作用或殺傷作用的目的基因表達(dá)產(chǎn)物，以包含體形式表達(dá)是最可取的生產(chǎn)途徑。目前二十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)五、包含體的形成與性質(zhì)（二）包含體的性質(zhì)1、包含體為高密度蛋白質(zhì)聚集體，密度約1.3g/ml.顆粒尺寸約0.1-1.0μm,有些達(dá)3μm，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物和表達(dá)系統(tǒng)而異。2、包含體通常位于細(xì)胞質(zhì)中，而一些分泌性蛋白質(zhì)可能在外周胞質(zhì)中形成。3、包含體的主要成分為基因表達(dá)產(chǎn)物，占包含體的50%以上，其他成分因表達(dá)系統(tǒng)而異，包括磷脂、微量的質(zhì)粒、rRNA和RNA聚合酶，更多的是黏附于包含體顆粒的外膜蛋白質(zhì)。目前二十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)六、包含體的分離純化與溶解1、包含體的分離包含體分離的最常用的方法就是：機(jī)械破碎后進(jìn)行離心沉降和膜分離（洗濾）。包含體為致密的蛋白質(zhì)聚集體，密度較大，達(dá)1.3g/ml，高強(qiáng)度的機(jī)械破碎后，低速離心便可沉淀，從而使之與細(xì)胞碎片和可溶性產(chǎn)物分離。目前二十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)六、包含體的分離純化與溶解2、包含體的純化原因：蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性和包含體的形成為動(dòng)力學(xué)競爭的結(jié)果。也就是說，蛋白質(zhì)的復(fù)性是分子內(nèi)折疊和分子間聚集反應(yīng)的競爭動(dòng)力學(xué)過程。因此，為了提高蛋白質(zhì)的復(fù)性收率，必須抑制聚集體的生成，促進(jìn)復(fù)性反應(yīng)向正確折疊的方向進(jìn)行。研究表明：在質(zhì)粒DNA、脂多糖和其他蛋白質(zhì)存在時(shí)，蛋白質(zhì)的聚集體生成速率增大，復(fù)性收率降低，而純化的變性/還原蛋白質(zhì)的復(fù)性收率可以得到大幅度的提高。因此，包含體的純度對(duì)復(fù)性收率影響顯著，為了實(shí)現(xiàn)較高的蛋白質(zhì)復(fù)性收率，必須進(jìn)行包含體的純化。

目前二十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)六、包含體的分離純化與溶解方法：包含體的純化過程因表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)產(chǎn)物而異，沒有通用的最佳方案。因此，對(duì)于特定的表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)產(chǎn)物，需要根據(jù)具體情況進(jìn)行過程開發(fā)試驗(yàn)，確定適宜的純化方案。經(jīng)常采用的包含體分離純化過程包括差速離心和反復(fù)洗滌步驟，以最大限度地清除難以去除的膜蛋白質(zhì)?？蓞⒖嫉囊话氵^程如下：目前二十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)六、包含體的分離純化與溶解路線1：①細(xì)胞破碎。為提高下一步的離心分離效率，需進(jìn)行高強(qiáng)度的破碎（利用高壓勻漿破碎時(shí)需反復(fù)操作多次）。②離心沉降回收包含體。在較高的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)（離心力）下除去可溶性組分和沉降速度較小的細(xì)胞碎片，回收沉降的粗包含體。③粗包含體的洗滌。向粗包含體中加入鰲合劑EDTA(乙二胺四乙酸)和低濃度變性劑（如1-4mol/L尿素，或1一2mol/L鹽酸胍）或表面活性劑（如1-20g/LTritonX-100聚氧乙烯烷基酚),溶解吸附在包含體表面的磷脂和膜蛋白質(zhì)。同時(shí)加入一定濃度的蔗糖，提高包含體懸浮液的密度。目前三十頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)六、包含體的分離純化與溶解④離心沉降回收包含體。在較低的轉(zhuǎn)數(shù)下離心分離，回收沉降的包含體。⑤根據(jù)需要，可重復(fù)上述步驟③和④，直至達(dá)到滿意的包含體純度。目前三十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)六、包含體的分離純化與溶解細(xì)胞破碎可采用機(jī)械破碎和酶解相結(jié)合的方法，以提高破碎效率。包含體純化過程中也可利用核酸水解酶，提高核酸去除率。DeBernardezClark等提出的利用酶解輔助細(xì)胞破碎和包含體純化的過程如下（路線II)：①離心分離，回收細(xì)胞。②向回收的細(xì)胞中加入含lmmol/LEDTA和1.5mg/mL溶菌酶的Tris緩沖溶液（三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液）(0.lmol/L,pH=7.0)，細(xì)胞濃度為20g/L（濕重），總體積為V。放置30min。目前三十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)六、包含體的分離純化與溶解③細(xì)胞破碎：反復(fù)機(jī)械破碎，使細(xì)胞破碎完全。④核酸水解：向細(xì)胞破碎液中加入DNA水解酶(DNase）至10μg/mL和MgCl2至3mmol/L。25℃溫浴30min，水解DNA。⑤包含體洗滌：向上述懸浮液中加人TritonX-100至20g/L,NaCl至1.5mo1/L,EDTA至20mmo1/L,懸浮液體積為3V。4℃攪拌30min。⑥離心分離回收包含體。⑦包含體洗滌：向回收的包含體中加入Tris至0.lmol/L(pH=7.0),EDTA至20mmol/L,懸浮液體積為8V。

⑧離心分離回收純化的包含體。目前三十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)六、包含體的分離純化與溶解3、包含體的溶解

目的：獲得適當(dāng)純度的包含體后，需要對(duì)包含體進(jìn)行溶解，使目標(biāo)蛋白質(zhì)的肽鏈伸展，為進(jìn)一步的復(fù)性創(chuàng)造條件。

方法：包含體溶解的方法：1、加入高濃度的強(qiáng)變性劑：如6-8mol/L的鹽酸胍或8mol/L的尿素。2、加入硫氰酸鹽或表面活性劑。3、對(duì)于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑解離錯(cuò)配的二硫鍵。目前三十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)六、包含體的分離純化與溶解常用的還原劑有1-100mmol/L的二硫蘇糖醇（DTT），1-200mmol/L的β-巰基乙醇和半胱氨酸等，有時(shí)還需要加入螯合劑,以清除重金屬離子（如加入2mol/L的EDTA等）。注意：溶解后的包含體蛋白質(zhì)中仍會(huì)存在一些諸如非目標(biāo)蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞膜組分等雜質(zhì)，為了提高復(fù)性收率，在復(fù)性前要對(duì)變形/還原的蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化。主要方法有凝膠過濾色譜、離子交換色譜、反相色譜和固定化金屬離子色譜等。純化操作中使用的流動(dòng)相需保證蛋白質(zhì)處于變性/還原狀態(tài)，如苯酚、正丁醇等。如果要保存變性蛋白質(zhì)，可以將蛋白質(zhì)變換到酸性溶液中（10%醋酸或5-10mmol/L鹽酸），并冷凍干燥。復(fù)性前用變性劑重新溶解干粉，就可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性操作。

目前三十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性(一)蛋白質(zhì)復(fù)性的方法目前三十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性1、直接稀釋復(fù)性：即將變性蛋白質(zhì)溶液直接稀釋到適宜的復(fù)性緩沖液中。變性蛋白質(zhì)是溶解在高濃度變性劑中的，降低變性劑濃度至非變性濃度范圍即可引發(fā)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。當(dāng)變性劑濃度降低后，伸展的肽鏈U迅速折疊成具有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)（α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)）和部分三級(jí)結(jié)構(gòu)的中間體I，該過程非常迅速，通常在幾毫秒內(nèi)完成，因此，I的生成可以認(rèn)為是瞬間完成（即ki→∞）,蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性和聚集體的形成過程可以簡化為從中間體I折疊成天然活性態(tài)N和生成聚集體A的平行反應(yīng)。AKaIKrN目前三十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性注意：聚集體的形成是蛋白質(zhì)過量表達(dá)的結(jié)果。因此，在這個(gè)過程中，蛋白質(zhì)的復(fù)性收率一般是隨變性蛋白質(zhì)溶液濃度的提高而降低的，而聚集體的生成速率隨濃度的提高而增大。即：U↑則I↑,N↓。因此，在稀釋復(fù)性過程中，若復(fù)性系統(tǒng)的混合不利，會(huì)造成局部蛋白濃度過高，使復(fù)性收率下降，在設(shè)計(jì)復(fù)性反應(yīng)器時(shí)，要盡量考慮混合攪拌均勻。目前三十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性對(duì)于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的復(fù)性，需要添加氧化劑和還原劑，調(diào)節(jié)復(fù)性液的氧化還原環(huán)境，促進(jìn)正確二硫鍵的形成，常見的氧化/還原劑有：氧化型谷光甘肽（GSSG）/還原型谷光甘肽（GSH）,胱氨酸/半胱氨酸或在金屬離子（如Cu2+）存在下的空氣中氧化。氧化復(fù)性通常在弱堿性（pH=7.5-9.5）緩沖溶液中進(jìn)行，在此pH值條件下有利于硫醇陰離子的形成，促進(jìn)二硫鍵的形成和交換。同時(shí)，氧化還原劑的濃度對(duì)復(fù)性收率影響顯著。具體濃度范圍要根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定。因?yàn)椋话闱闆r下，不同蛋白質(zhì)的最佳復(fù)性條件不同，并且同一種蛋白質(zhì)在不同濃度下的最佳條件也不完全相同，這也是蛋白質(zhì)復(fù)性的特點(diǎn)和難點(diǎn)之一。目前三十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性2、流加復(fù)性

降低蛋白質(zhì)濃度有利于獲得較高的復(fù)性收率，因此，為了提高復(fù)性收率，通常需要在較低的濃度下進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性操作，有時(shí)蛋白質(zhì)的濃度需低于0.01mg/ml。但是，降低蛋白質(zhì)濃度勢(shì)必會(huì)增大復(fù)性液的體積，給后續(xù)的分離純化增加困難。為了實(shí)現(xiàn)高濃度下的高收率復(fù)性，產(chǎn)生了將變性蛋白質(zhì)分批次加入到復(fù)性液中或采用連續(xù)流加到復(fù)性液中的流加復(fù)性法。由于在流加變性蛋白質(zhì)的同時(shí)，復(fù)性液中的蛋白質(zhì)發(fā)生折疊復(fù)性，使變性蛋白質(zhì)（折疊中間體）濃度始終保持在較低的水平，最終可在較高的蛋白質(zhì)濃度下獲得較高的復(fù)性收率。目前四十頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性3、透析（或洗濾）復(fù)性：即采用高親水性膜材料進(jìn)行透析或超濾的方法降低變性劑濃度和調(diào)節(jié)復(fù)性液的氧化還原環(huán)境。4、添加劑輔助復(fù)性：由于聚集體的形成是導(dǎo)致復(fù)性收率降低的主要原因，在控制復(fù)性液的pH值、溫度和氧化還原劑濃度等參數(shù)同時(shí)，研究者努力嘗試在稀釋復(fù)性中添加各種小分子溶質(zhì)，以抑制聚集體的生成。即利用添加一些小分子溶質(zhì)等輔助因子的稀釋復(fù)性法，又稱為稀釋添加復(fù)性。常用的稀釋添加劑見下表。目前四十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性目前四十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性目前四十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性添加劑輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的機(jī)理尚不完全清楚，但一般認(rèn)為主要有以下兩種作用：①穩(wěn)定天然肽蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，降低錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；②提高折疊中間體或伸展肽鏈的溶解度（穩(wěn)定性）。不同添加劑的作用機(jī)理不同。甘油的作用是穩(wěn)定天然態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，提高其熱力學(xué)穩(wěn)定性，促進(jìn)折疊反應(yīng)的進(jìn)行；低濃度變性劑、聚乙二醇和表面活性劑等其他大部分添加劑的作用是提高折疊中間體或伸展膚鏈的溶解度，抑制聚集體的生成。低濃度變性劑（如鹽酸胍）可誘導(dǎo)酸變性蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的生成，穩(wěn)定復(fù)性過程中的熔球態(tài)中間體。目前四十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性蛋白質(zhì)折疊復(fù)性過程復(fù)雜多變，利用稀釋添加劑需要注意如下問題：①添加劑輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的作用具有選擇性，即一種添加劑可能對(duì)某種蛋白質(zhì)復(fù)性具有輔助作用，而對(duì)其他蛋白質(zhì)復(fù)性無作用，甚至起反作用。例如，聚乙二醇可輔助碳酸脫水酶(carbonicanhydraseB)復(fù)性，但對(duì)溶菌酶復(fù)性無影響。目前四十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性②對(duì)于那些穩(wěn)定折疊中間體或伸展膚鏈的添加劑，添加劑的輔助作用在一定的濃度范圍內(nèi)有效，即存在最佳濃度或濃度范圍。在較低的濃度下添加劑的輔助作用不明顯，而在較高的濃度下復(fù)性收率亦降低。這是由于這類添加劑在抑制聚集體生成的同時(shí)，也會(huì)抑制蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，造成折疊速率和聚集體生成速率均隨濃度提高而下降。③添加劑的最佳濃度或濃度范圍與蛋白質(zhì)種類和濃度有關(guān)。即不同蛋白質(zhì)復(fù)性所需的添加劑濃度不同，并且隨蛋白質(zhì)濃度的提高，所需添加劑濃度也會(huì)提高。因此，一般添加劑的輔助作用在較低的蛋白質(zhì)濃度下（＜0.1-lmg/mL）有效，在較高的蛋白質(zhì)濃度下由于分子間聚集的趨勢(shì)強(qiáng)烈，添加劑的作用不明顯。目前四十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(diǎn)七、蛋白質(zhì)復(fù)性④在生理環(huán)境下，低濃度蛋白質(zhì)的折疊可在數(shù)分鐘內(nèi)完成，一般不超過60min。但是，大部分添加劑在抑制聚集體生成的同時(shí)，也會(huì)抑制蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，造成折疊速率降低。因此，在這類添加劑的存在下，由于復(fù)性速率較低，需要較長的復(fù)性時(shí)間（(5-40h)才能獲得較高的復(fù)性收率。因