貝克曼流式細胞儀原理及軟件介紹

流式細胞儀

FLOWCYTOMETER原理及軟件介紹目前一頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點BeckmanCoulter流式細胞儀發(fā)展史1947年WallaceCoulter發(fā)明了庫爾特原理，用于血細胞分析1953年推出了世界上第一臺流式細胞分析儀CoulterCounterModelA1972年推出世界上第一臺激光流式細胞儀EPICSII1975年研制出世界上第一臺帶計算機的流式細胞儀1997年推出世界上第一臺單激光四色數(shù)字化流式細胞儀EPICSXL/MCL2000年首先將高精度數(shù)字化顏色補償技術ADC（AdvancedDigitalCompensation）應用于流式平臺，引領流式進入全新的全矩陣補償、全自動補償和脫機補償時代2003年推出世界上第一臺單激光五色的流式細胞儀FC500/MCL，2005年升級為FC500/MPL2006年推出世界上第一臺具有EV參數(shù)同時進行無成本絕對計數(shù)的多功能細胞分析系統(tǒng)QuantaSC，將流式細胞術與庫爾特原理完美結合，2007年推出MPL進樣系統(tǒng)2007年收購Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成為高端流式市場的領導者2009年，推出世界是第一臺三激光十色的分析型流式細胞儀Gallios/Navios目前二頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點EPICSXL-ADC

QUANTASCCytomicsFC500BeckmanCoulterCelllabFamilyMoFloXDPGallios/NaviosCyanADP目前三頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點FC500硬件目前四頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點Whatisflowcytometry?流式細胞術是單個細胞/顆粒流過檢測裝置過程中，檢測到的物理和/或化學的特性。HowardShapiro,PracticalFlowCytometry,3rdEdition目前五頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點分類分析型：只能分析用，液流進入廢液筒分選型：回收目標細胞，用于后續(xù)實驗。要求管道絕對無菌。目前六頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點基本原理流路（液流系統(tǒng)）流動室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細胞懸液5*105~1*106個/ml光路（光學系統(tǒng)）光源濾片光電倍增管PMTHV電路（電路系統(tǒng)）放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換分析系統(tǒng)：計算機目前七頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點液流系統(tǒng)目前八頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點流路構造目前九頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點流路單細胞懸液大多數(shù)儀器是在50-300μm大小的孔徑中,將細胞懸液注射進入鞘液中這一過程,成為流體動力學聚焦目前十頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點FLOWCELLInjector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluid目前十一頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點光路系統(tǒng)目前十二頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點光路構造目前十三頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點光路光源檢測信號散射光信號

FS:前向角散射光

SS:側向角散射光(90度散射光)

熒光信號 熒光染料 光學濾片目前十四頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點

光路光源 與通過的細胞聚焦在同一點上激光

空冷 488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,空冷/水冷EnterpriseII水冷Innova300系列 Innova70系列目前十五頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點常用激光器及其通道分配表目前十六頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點檢測信號目前十七頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點散射光信號—前向散射光(FS)FS----Forward

(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的檢測器,為前向散射光檢測器

FS的強度與細胞或其他顆粒的大小,形狀及opticalhomogeneity有關FS用于檢測細胞或其他粒子的表面屬性 如:大小目前十八頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點FALSSensorLaser前向散射光

目前十九頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點前向散射光目前二十頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點散射光信號–側向散射光SS-Side

(AngelLight)Scatter

與激光束垂直方向的檢測器為側向檢測器,也稱為90度散射光檢測器SS用于檢測細胞內(nèi)部結構 如:胞漿內(nèi)顆粒多少,核質(zhì)比目前二十一頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點FALSSensor90LSSensorLaser側向散射光目前二十二頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點側向散射光目前二十三頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點90DegreeScatter0

200

400

600

8001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale目前二十四頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點光路-熒光信號每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長,并激發(fā)后會有發(fā)射波長,流式細胞儀檢測的即是它特定的發(fā)射波長.

利用各種不同波長的光學濾片來收集(檢測)這些光學信號目前二十五頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)目前二十六頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC633 670目前二十七頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點5ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5/PC7目前二十八頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點熒光染料比較(平均熒光強度)

Q-Prep/ImmunoPrep試劑系統(tǒng)PerCP<APC<FITC<ECD<PC5<PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APC目前二十九頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)目前三十頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點光路-濾片特性

長通濾片

–

允許長于設定波長的光通過

短通濾片–

允許短于設定波長的光通過

帶通濾片–

允許一定帶寬的波長通過目前三十一頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點光路-濾片特性當以45o

角放置濾片時,該濾片可以通過一定波長的光,同時也可以阻斷并折射該波長以下的光

這種方式的濾片稱為二向色性濾片(dichroicfilter)

目前三十二頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點濾片帶通濾片BANDPASS(BP)只允許某些波長的光通過二向色性濾片DICHROICFILTER一定波長以上通過，該波長以下折射630nmBandPassFilterTransmittedLightWhiteLightSource620-640nmLightDichroicFilter/Mirrorat45degReflectedlightTransmittedLightLightSource目前三十三頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點目前三十四頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點電路系統(tǒng)目前三十五頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點Optics-DetectorsPhotomultipliertube(PMT)

將光學信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字數(shù)據(jù))信號

目前三十六頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點不同的脈沖信號被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道(CHANNEL)的過程

目前三十七頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點目前三十八頁\總數(shù)四十四頁\編于十八點SingleParameterHistogram:CountvsMFI目前三