實驗一 質粒DNA的提取

實驗目的了解堿法提取質粒的原理；掌握堿法提取質粒的方法；掌握DNA瓊脂糖電泳的原理和方法。目前一頁\總數(shù)二十五頁\編于九點實驗原理

質粒是一種細菌染色體外的、具有自主復制能力的、共價閉合環(huán)狀超螺旋結構的小型DNA分子。堿裂解法提取質粒是實驗室常用的方法。這種方法是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。目前二頁\總數(shù)二十五頁\編于九點結構的三大要素：

多克隆位點選擇標記（耐藥性，LacZ）獨立的復制單位種類：

質粒噬菌體酵母人工染色體（YAC）反轉錄病毒載體表達載體等目前三頁\總數(shù)二十五頁\編于九點目前四頁\總數(shù)二十五頁\編于九點pET-32aVectorThepETSystemisthemostpowerfulsystemyetdevelopedforthecloningandexpressionofrecombinantproteinsinE.coli.目前五頁\總數(shù)二十五頁\編于九點pET-32cloning/expressionregion目前六頁\總數(shù)二十五頁\編于九點Vector(pET-32a)Genefragment(SmPR10)pET-32a-SmPR10目前七頁\總數(shù)二十五頁\編于九點

質粒的分離是利用質粒DNA與染色體DNA在變性與復性中的差異來達到的目的。當菌體在NaOH和SDS溶液(堿性條件pH12.5)中裂解時，蛋白質與DNA發(fā)生變性，由于染色體DNA與質粒DNA拓樸構型不同，染色體DNA雙螺旋結構解開，而共價閉環(huán)質粒DNA的氫鍵雖被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞仍會緊密地結合在一起。當加入乙酸鉀溶液pH恢復至中性時,在高鹽濃度的情況下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結構并與蛋白質-SDS復合物等形成沉淀；不同的是，質粒DNA復性迅速而準確，保持可溶狀態(tài)而留在上清中。這樣，通過離心可沉淀大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質。除去沉淀后上清中的質粒可用酚氯仿抽提進一步純化質粒DNA。用異丙醇或乙醇沉淀后洗滌，可得到較純的質粒DNA。>4000kb1kb到200kb目前八頁\總數(shù)二十五頁\編于九點實驗儀器、材料與試劑（一）儀器1.恒溫搖床2.超凈工作臺3.高壓滅菌鍋4.高速臺式離心機5.微量取液器目前九頁\總數(shù)二十五頁\編于九點目前十頁\總數(shù)二十五頁\編于九點目前十一頁\總數(shù)二十五頁\編于九點目前十二頁\總數(shù)二十五頁\編于九點目前十三頁\總數(shù)二十五頁\編于九點（二）材料大腸桿菌E.coliDH5α含重組質粒pET-32a-SmPR10目前十四頁\總數(shù)二十五頁\編于九點（三）試劑1.LB液體培養(yǎng)基（1L）胰蛋白胨10g

酵母提取物5gNaCl10g

加去離子水至800ml，攪拌，使溶質完全溶解，用NaOH調節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1升，高壓蒸汽滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基（1L）在上述LB液體培養(yǎng)基（1L）中加入瓊脂粉15g。

目前十五頁\總數(shù)二十五頁\編于九點2.溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L）；Tris·HCl（25mmol/L，pH8.0）；EDTA（10mmol/L）3.溶液Ⅱ：NaOH（0.2mol/L）；SDS（1%，新鮮配制）4.溶液Ⅲ：60ml的5mol/LKAC；11.5ml的冰醋酸；28.5mlH2O溶液I：低濃度的葡萄糖溶液使細胞處于低滲狀態(tài)而細胞澎脹；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，減少抽提過程中的機械剪切作用，防止破壞DNA。

EDTA的作用是螯和掉Mg2+、Ca2+等二價金屬離子，防止DNA酶對質粒分子的降解作用。

Tris?Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍。溶液II：SDS的作用：破壞細胞膜；解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之變性。

NaOH(pH>12)的作用：破壞氫鍵，使DNA分子變性。溶液III：由KAc與HAc組成，是pH值為5.5的高鹽溶液。能中和溶液II的堿性，使DNA復性。但是質粒DNA與染色體DNA復性的速度不同。K+離子會與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質形成沉淀而除去。溶液中的染色體DNA也會與蛋白質-SDS形成相互纏繞的大分子物質，很容易與小分子的質粒DNA分離。目前十六頁\總數(shù)二十五頁\編于九點5.氨芐青霉素（Amp）用無菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.RNaseA

將RNA酶A溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。7.酚/氯仿(1:1)，氯仿/異戊醇(24:1)，乙醇，75%乙醇。

目前十七頁\總數(shù)二十五頁\編于九點實驗步驟

質粒的提取

1.用滅菌的牙簽挑取單菌落放入1-2mlLB液體培養(yǎng)基（含Amp0.1mg/ml）中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。2.將菌液倒入1.5mlEppendorf管中，10,000rpm離心1min，棄上清液。3.加入100lSolutionI，渦旋使細胞充分懸浮。4.加入200lSolutionII，立即上下顛倒離心管5-10次，使之混勻（注意動作輕），冰上放置5min。5.加入150lSolutionIII，立即上下顛倒離心管5-10次，使之混勻（注意動作輕），冰上放置5min。目前十八頁\總數(shù)二十五頁\編于九點6.15,000rpm，離心10min，將上清移至一干凈的1.5mlEppendorf管中，注意所取體積（約400l）。7.加入等體積酚/氯仿（1:1），顛倒數(shù)次混勻（注意動作輕），12,000rpm，4℃，離心3min，取上清液。8.小心吸取上清液中至一干凈的1.5mlEppendorf管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1），顛倒數(shù)次混勻，12,000rpm，4℃，離心3min，取上清液。目前十九頁\總數(shù)二十五頁\編于九點9.小心吸取上清液中至一干凈的1.5mlEppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，顛倒混勻，于冰上放置10min，4℃離心，15,000rpm，10min。10.棄上清，加1ml75%乙醇漂洗沉淀，4℃離心，10,000rpm，5min。11.去掉上清（注意沉淀勿丟失），室溫或真空干燥沉淀。12.加入50lTEbuffer，室溫振蕩溶解質粒DNA。目前二十頁\總數(shù)二十五頁\編于九點培養(yǎng)細菌使質粒擴增1.挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至2mlLB培養(yǎng)液中（含Amp100g/ml)37℃搖蕩培養(yǎng)過夜。2.取1ml菌液轉接到一個含有100mlLB培養(yǎng)液三角瓶中(含Amp100g/ml）,37℃搖蕩培養(yǎng)過夜。37℃振搖過夜37℃振搖過夜目前二十一頁\總數(shù)二十五頁\編于九點

Tiangen質粒DNA小量提取試劑盒（實際用）操作過程1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500l的平衡液BL，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。2.將1-2ml過夜培養(yǎng)的細菌菌液加入1.5ml離心管中，12,000rpm離心1分鐘，并棄去上清液。如有需要，可多次重復步驟2，以收集更多細菌菌體。但勿過量，以免影響提取質粒的質量。3.加200l溶液P1（用前檢查是否已加入RNaseA），重懸細菌體沉淀，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。目前二十二頁\總數(shù)二十五頁\編于九點4.加200l溶液P2，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。注意不要劇烈振動，以防止基因組DNA被打斷，注意不要讓反應持續(xù)超過5分鐘。5.加300l溶液P3，立即輕柔顛倒離心管6-8次，充分混勻，此時溶液應該出現(xiàn)白色絮狀沉淀。6.12,000rpm離心10分鐘。如離心機轉速不夠可延長離心時間，直至形成緊密的白色沉淀。7.將步驟6離心后得到的上清液轉移到吸附柱CP3中，12,000rpm離心30-60秒，并棄去接液管內(nèi)液體。8.向吸附柱CP3內(nèi)加600l漂洗液PW，12,000rpm離心30-60秒，并棄去收集管內(nèi)廢液。9.重復第8步一次。目前二十三頁\總數(shù)二十五頁\編于九點10.將吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm離心2分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP3開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。11.將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加40l洗脫緩沖液EB，室溫放置2