考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定第1頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四提綱前言材料與方法結(jié)果與分析研究目的及意義第2頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四前言

1紫菜的生物學(xué)特征紫菜（Porphyra）屬于紅藻門（Rhodophyta）紅藻綱（Rhodophyceae）紅毛菜亞綱（Bangiophycidae）紅毛菜目（Bangiales）紅毛菜科（Bangiaceae）。目前報(bào)道的種類約有130多種，廣泛分布在世界各地。東亞地區(qū)屬紫菜盛產(chǎn)區(qū)域，條斑紫菜（Porphyrayezoensis）是中、日、韓三國共同栽培品種，在我國長江以北廣泛栽培，而在長江以南栽培的壇紫菜（P.haitanensis）屬我國特有。條斑紫菜為北太平洋西部特有的種類，自然界主要分布于我國東海北部和黃、渤海沿岸，以及日本列島和朝鮮半島沿岸。條斑紫菜藻體為葉片狀，葉形多為卵形或長卵形，隨生長環(huán)境有較大的變化。壇紫菜主要產(chǎn)于我國福建和浙江沿海，盛產(chǎn)于福建的平潭、莆田、惠安等縣，為我國特有的暖溫帶性種類，藻體披針形、亞卵形或長卵形。第3頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四紫菜的營養(yǎng)價(jià)值

紫菜（Porphyra）作為一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值巨大的栽培紅藻，以其營養(yǎng)豐富、口感良好深受特別是東亞地區(qū)人民的喜愛。紫菜中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、膳食纖維、胡蘿卜素、維生素A、維生素B1、B2，維生素C、維生素B12和膽堿等多種有機(jī)物質(zhì)，同時(shí)還含有人體所需的Ca、P、Fe、Mg、I、Se、Zn和Mn等多種礦物質(zhì)。劉興寬，郁建平(2008)在對(duì)沿海灘涂甘紫菜營養(yǎng)成分分析中，檢測(cè)出15種游離氨基酸和16種水解氨基酸，必需氨基酸占游離氨基酸總量的24．35％，占水解氨基酸總量的39.81％；維生素和微量元素種類多、含量高，樣品中Vc含量為17.2mg／100g；微量元素中Na的含量最高為356.7mg／100g，其次是Ca、Mg和K，Pb和Cu的含量遠(yuǎn)低于指標(biāo)值。第4頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四仲明等（2003）在對(duì)條斑紫菜不同采收期主要營養(yǎng)成分變化情況中指出條斑紫菜的鈣、鎂、鋅和碘含量較豐富，尤其是鈣和碘含量較多，鉛、鎘含量均低于食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。所含的維生素種類多、含量高，明顯高于動(dòng)物性食品，胡蘿卜素、維生素E含量尤為突出。蛋白質(zhì)的含量是衡量紫菜品質(zhì)優(yōu)劣的一項(xiàng)重要指標(biāo)。紫菜中的蛋白質(zhì)含量隨著藻的種類及生長時(shí)間、地點(diǎn)等而有所不同，通常蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)占紫菜干質(zhì)量的25%～50%。第5頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四牛建峰等（2006）利用Bradford法，測(cè)得60℃恒溫干燥的帶形蜈蚣藻可溶性總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.33％，帶形蜈蚣藻是紅藻門蜈蚣藻屬植物，其可溶性蛋白含量很少。劉淑梅等（2009）對(duì)9份辣椒種子的可溶性蛋白含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明辣椒種子蛋白含量為25.65％～29.22％，遠(yuǎn)高于其他蔬菜類作物的蛋白質(zhì)含量，辣椒種子蛋白質(zhì)含量是辣椒皮的20倍，辣椒種子蛋白質(zhì)僅低于大豆的蛋白含量(36.23％~49.26％)。這表明辣椒種子具有較高的蛋白質(zhì)開發(fā)價(jià)值。粱月等（2010）通過對(duì)布澤烏區(qū)采集的不同品種漿果分析得出可溶性蛋白含量從22.39％~45.35％，含量很高。第6頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)的測(cè)定方法

在許多蛋白質(zhì)研究的領(lǐng)域中，用一種快速準(zhǔn)確的方法來檢測(cè)蛋白濃度是必不可少的。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有多種，如凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、等電點(diǎn)沉淀法、考馬斯亮藍(lán)染色法等幾種方法，但就方法的準(zhǔn)確性和精密度以及應(yīng)用程度而言，國際經(jīng)典測(cè)定方法——?jiǎng)P氏定氮法為首選。現(xiàn)在盡管有很多先進(jìn)的自動(dòng)或半自動(dòng)凱氏定氮儀，但這些儀器不僅價(jià)格昂貴，且需專門試劑，目前尚難普及[21]。一種新建立的考馬斯亮藍(lán)法在許多實(shí)驗(yàn)中已成為首選方法用來定量的檢測(cè)蛋白濃度。第7頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)最常用的方法是凱氏定氮法。凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過程。在催化劑作用下,試樣用濃硫酸消煮破壞有機(jī)物,使其中的蛋白質(zhì)氮及其他有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮,然后與硫酸結(jié)合生成硫酸銨,加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾使氨逸出,用硼酸吸收后,再用酸滴定,測(cè)出含氮量,將結(jié)果乘以換算系數(shù),計(jì)算出粗蛋白質(zhì)含量。然而該方法存在消化時(shí)間太長,會(huì)產(chǎn)生有毒有害該方法存在消化時(shí)間太長，會(huì)產(chǎn)生有毒有害氣體，因此必須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行的弊端。宗留香等人對(duì)這一傳統(tǒng)方法進(jìn)行了改進(jìn)，即用Se粉作催化劑進(jìn)行消化，不用通風(fēng)櫥，即實(shí)現(xiàn)了環(huán)保消化，并提高了消化效率。第8頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)G一250測(cè)定蛋白質(zhì)含量原理是屬于染料結(jié)合法的一種，存在紅色與藍(lán)色兩種不同的顏色形式。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合時(shí)變?yōu)樗{(lán)色?？捡R斯亮藍(lán)G—250與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而且穩(wěn)定，反應(yīng)2min左右即達(dá)到平衡，其結(jié)合物可在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定?？捡R斯亮藍(lán)G-250法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1μg，比Lowry法的靈敏度高約4倍，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)—染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大得多。該法方法簡便，易于操作，所用試劑較少，顯色劑易于配制；干擾物質(zhì)少，如糖、緩沖液還原劑和絡(luò)合劑等均不影響顯色。第9頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)果與分析

2.1測(cè)定波長的選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取160ug/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液用LAMBDA25紫外/可見光光度計(jì)450～750nm進(jìn)行波長掃描,由掃描曲線可見標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的最大吸收波長為595nm,，故本法選擇的測(cè)定波長為595nm。圖1最大吸收峰的測(cè)定Fig.1Analysiaoftheproperabsorbing第10頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四2.2顯色穩(wěn)定性考察

取1ml200ug/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻，放置3min后倒入比色皿，在595nm處，每隔30s測(cè)定其吸收度，測(cè)定結(jié)果如下圖所示：

圖2穩(wěn)定性考察Fig.2Investigationonthestability第11頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四陸建良等(2002)的研究表明，蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合后，在2~5min即呈最大光吸收，至少穩(wěn)定1h。我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合，即使在5min到20min后，在595nm處的光吸收值也不是很穩(wěn)定，總是在一定幅度內(nèi)擺動(dòng)，如果儀器的靈敏度高，這種擺動(dòng)誤差就更大。為了減少試驗(yàn)誤差，應(yīng)將儀器的狹縫調(diào)大些，以降低靈敏度，增加穩(wěn)定性。第12頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四

2.3蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制圖3蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig3Thestandardcurveoftheproteins

一月二月第13頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四

三月四月第14頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四1，2，3，4月采集樣品蛋白測(cè)定的回歸方程分別為：y=0.0049x+0.1398，r=0.0093；y=0.005x+0.1262，r=0.9994；y=0.0049x+0.1464，r=0.9993；y=0.0048x+0.2774，r=0.9992。各次測(cè)定的蛋白回歸方程式相關(guān)系數(shù)r在0.9992～0.9994之間，蛋白含量與595nm處吸光值線性關(guān)系良好。第15頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四2.4不同紫菜可溶性蛋白含量隨生長時(shí)期不同而變化

圖4不同紫菜中蛋白含量Fig.4.ThedissolvableproteincontentsofdifferentPorphyramg/gSTDEV1月2月3月4月1月2月3月4月對(duì)照241.73±4.29247.31231.69219.353.762.123.35Y-L0601220.92231.67187.50154.564.582.883.627.70Y-L0602205.00227.36175.30148.624.624.873.141.50Y-06DO206.21230.51185.34170.207.014.016.393.77Y-gr282.37290.77208.96192.9312.545.905.181.80壇紫菜190.60194.91172.72142.113.232.412.754.43第16頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四一月Y-gr組測(cè)得的蛋白含量最高，為282.37+12.54；對(duì)照組測(cè)得的蛋白含量為241.73+4.29，居第二；其次是Y-L0601含量為220.92+4.58；Y-06DO含量為206.21+4.01；Y-L0602含量為205.00+4.62；最低的是壇紫菜含量為190.60+3.23。二月所有組的蛋白含量同一三四月比都是最高的，蛋白質(zhì)的含量是衡量紫菜品質(zhì)優(yōu)劣的一項(xiàng)重要指標(biāo)，所以一二三四月中二月可能是采收的最好季節(jié)。第17頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四三月蛋白含量和二月相比普遍下降，下降最明顯的是Y-gr，從二月的290.77+5.90mg/g下降到三月的208.96+5.18mg/g；其次為Y-L0602從二月的227.36+4.87mg/g下降到三月的175.30+3.14mg/g；最低的是對(duì)照組從二月的247.13+3.76下降到三月的231.69+2.12mg/g。四月采集的各樣品中蛋白含量是各生長時(shí)期最低的，各紫菜樣品中含量存在較大差異。對(duì)照組蛋白含量最高，壇紫菜最低。蛋白含量從高到低順序?yàn)椋簩?duì)照>Y-gr>Y-06DO>Y-L0601>Y-L0602>壇紫菜。第18頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四圖5紫菜中蛋白含量隨生長時(shí)間的變化Fig.5ThedissolvableproteincontentsofdifferentstageofPorphyra第19頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四

一月二月，Y-gr樣品的蛋白含量高于其他5個(gè)組，三月四月僅次于對(duì)照組。壇紫菜的蛋白含量始終最低。蛋白含量隨生長時(shí)間的變化呈明顯的規(guī)律，1，2月采集樣品中蛋白含量較高，隨后其蛋白含量均出現(xiàn)一定程度的下降。Y-gr下降程度最高，下降了28.13%，其次為Y-L0602下降了22.90%，接著是Y-06DO下降了19.60%，Y-L0601下降了19.07%，壇紫菜下降了11.38%，最低的是對(duì)照組下降了6.32%。第20頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四以上結(jié)果均說明，紫菜中可溶性蛋白含量不僅與藻的種類及其品系密切相關(guān)，而且同一紫菜蛋白含量隨生長時(shí)期的變化有所差異。姚興存等（2002）對(duì)連云港沿海條斑紫菜一般營養(yǎng)成分進(jìn)行了測(cè)定及研究與分析了隨季節(jié)變化的規(guī)律，結(jié)果表明幾種營養(yǎng)成分中，含量變動(dòng)最為明顯的是蛋白質(zhì)和碳水化合物，二者之間呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。在紫菜生長的前期蛋白質(zhì)含量高，之后隨生長時(shí)間的延長，逐漸減少，而碳水化合物則恰恰相反。分析原因是由于處在生長初期的紫菜細(xì)胞不斷地進(jìn)行分裂，以蛋白質(zhì)為中心的代謝十分旺盛。相反到了生長末期，細(xì)胞分裂能力下降，碳水化合物的代謝變得旺盛，使得細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙物質(zhì)增厚增多起來。由此，生長初期的紫菜加工出來的紫菜制品，營養(yǎng)價(jià)值較高，色、香、味也達(dá)到較高水平，生長末期的加工產(chǎn)品則品質(zhì)出現(xiàn)一定程度的下降。第21頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有多種,如凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、等電點(diǎn)沉淀法、考馬斯亮藍(lán)染色法等幾種方法,但就方法的準(zhǔn)確性和精密度以及應(yīng)用程度而言,國際經(jīng)典測(cè)定方法—?jiǎng)P氏定氮法為首選。