脆性X綜合征診斷與治療新進(jìn)展

脆性X綜合征診斷與治療新進(jìn)展第一頁，共31頁。脆性X綜合征(fragileXsyndrome,FXS)是引起先天性智力低下的常見疾病，新生兒發(fā)生率為0.4‰~0.67‰，占X連鎖智力低下病人的1/2~1/3。男性發(fā)病率約為1/4000，女性發(fā)病率約為1/6000~1/8000，前突變的攜帶者在男性中約為1/800，而在女性中則高達(dá)1/100~1/200。第二頁，共31頁。FXS發(fā)病率僅次于先天愚型，占智力低下的2%,估計(jì)20％IQ水平30~55之間的男性患有該病。給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。同時(shí)FXS具有家族遺傳性且臨床表現(xiàn)復(fù)雜。為臨床診斷和治療帶來了極大的困難。第三頁，共31頁。FXS是一種單基因遺傳性疾病，是由于Xq2.7.3的脆X智力低下1(fragileXmentalretardation1,FMR1)基因突變導(dǎo)致其5’端(CGG)n三核苷酸重復(fù)序列異常擴(kuò)增，當(dāng)擴(kuò)增達(dá)到一定數(shù)目后便會出現(xiàn)該基因異常甲基化,使FMR1基因的轉(zhuǎn)錄功能降低,導(dǎo)致其編碼的脆X智力低下蛋白(fragileXmentalretardationprotein,FMRP)減少,引起相應(yīng)的癥狀。第四頁，共31頁。FXS臨床癥狀常表現(xiàn)為不同程度的智力低下和發(fā)育延遲，男性患者平均IQ在中度以下，20%男性患者IQ水平在30-50之間。女性患者受累較男性為輕，智力低下常不嚴(yán)重，在輕度至臨界范圍。青春期前的男性患者表現(xiàn)多樣：逃避行為，逃避注視、孤僻癥、過度興奮、注意力不集中或多動(dòng)癥、動(dòng)作刻板、睡眠紊亂、語言發(fā)育也常受影響，多有輕度交流障礙；第五頁，共31頁。軀體特征在不同年齡、不同個(gè)體中差異較大，成年男性患者可有特殊面容：臉型狹長、大耳朵、眉弓及下頜突出，上述表現(xiàn)可隨年齡的增加而愈加明顯。但有時(shí)即使是受累嚴(yán)重的典型未成年男性患者其面部特征也可表現(xiàn)輕微，往往難以引起人們的注意。第六頁，共31頁。1FXS臨床診斷方法新進(jìn)展FXS是由于FMR-1基因5′端(CGG)n重復(fù)系列大量擴(kuò)展的結(jié)果，如果(CGG)n重復(fù)上升到230至1000次之間，就會產(chǎn)生FXS。目前對于脆性X綜合征的診斷主要依賴于實(shí)驗(yàn)室檢查。第七頁，共31頁。根據(jù)2005年最新ACMG指南對于以下幾種臨床情況應(yīng)進(jìn)行分子生物學(xué)檢測：⑴智力缺陷,發(fā)育遲緩,性格孤僻,行為體征疑為脆性X綜合征者；⑵具有不明原因的智力障礙者；⑶具有脆性X綜合征家族史者；⑷具有脆性X綜合征或不明原因智力缺陷家族史，生育前進(jìn)行遺傳咨詢者；⑸脆性X綜合征攜帶者母親的胎兒；⑹卵胞刺激素升高并伴有卵巢早衰的婦女，特別是具有不明原因智力缺陷家族史者；⑺未明原因的新發(fā)震顫/小腦性共濟(jì)失調(diào)患者，特別是伴有不明原因的智力缺陷家族史者。。第八頁，共31頁。FXS實(shí)驗(yàn)室診斷方法有細(xì)胞遺傳學(xué)、Southern印跡雜交、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、RT-PCR和免疫組化分析第九頁，共31頁。1．1細(xì)胞遺傳學(xué)檢測

該方法至盡今已發(fā)展成熟。診斷的重要指標(biāo)：培養(yǎng)中期細(xì)胞染色體Xq2.7顯示脆性位點(diǎn)大于4%為陽性。甲氨蝶呤或5-氟脫氧尿苷可誘導(dǎo)出脆性位點(diǎn)提高顯現(xiàn)率，與原位雜交熒光技術(shù)結(jié)合可分析檢測數(shù)量和結(jié)構(gòu)的異常并提高圖譜分辨率至10萬bp。fra(X)并不是在所有的中期細(xì)胞中都能找到，標(biāo)本來源于外周淋巴細(xì)胞、羊水、絨毛或臍血。一般智力低下男性患者fra(X)的表達(dá)率為10%~30%。年齡較大、表型正常的女性攜帶者可不表達(dá)，表達(dá)常低于5%。故不用于對表型正常的女性攜帶者的診斷。該法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、檢出率低于50%，且只能對男性患者及部分女性患者做出診斷，不能檢出不全顯性患者及女性雜合子，對于男性患者也易產(chǎn)生假陰性。所以應(yīng)用較局限。第十頁，共31頁。1．2Southern印跡雜交法

FXS5’端的（CGG）n的異常擴(kuò)增及CpG島異常甲基化使其上的特異性酶切位點(diǎn)消失，需用限制性核酸內(nèi)切酶識別、結(jié)合并切割特異性序列，產(chǎn)生不同長度的核酸片段，用于診斷。根據(jù)待測片段的大小選擇合適內(nèi)切酶。全突變使用HindIII或EcoRI可得到很強(qiáng)的雜交信號，不完全突變需使用PstI方可產(chǎn)生清晰的高分辨條帶。第十一頁，共31頁。目前認(rèn)為應(yīng)用較遠(yuǎn)側(cè)探針（StB12.3）對雙酶解（如EcoRI/EagI）DNA樣本進(jìn)行雜交，可檢出全部前突變和全突變等位基因及嵌合體狀態(tài)，同時(shí)可了解甲基化狀態(tài)，是最可靠的診斷方法。Southern印跡雜交法缺點(diǎn)為：需要DNA樣品多、需要同位素標(biāo)記、操作復(fù)雜、費(fèi)用大、耗時(shí)長、不易推廣；若酶解不完全會產(chǎn)生雜交帶，可產(chǎn)生錯(cuò)誤診斷；較難鑒別(CGG)n大的正常個(gè)體和小的前突變個(gè)體；有較大的漏診率和約5%的誤診率。第十二頁，共31頁。1．3聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

為目前快速、準(zhǔn)確檢測（CGG）n重復(fù)的方法，傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)技術(shù)可以檢測正常個(gè)體及小片段的前突變等位基因的（CGG）n重復(fù)數(shù)。對于較長片段的前突變及全突變患者，由于高的GC含量，序列內(nèi)部易于形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)不易擴(kuò)增，可利用甲基化敏感性聚合酶鏈反應(yīng)（methylationsensitivePolymeraseChainReaction;ms-PCR），引入特異性的引物使擴(kuò)增不出來的等位基因產(chǎn)生smear條帶，通過不同的探針標(biāo)記引物，利用毛細(xì)管電泳法檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，可以準(zhǔn)確的檢測（CGG）n重復(fù)數(shù)。結(jié)合普通PCR及ms-PCR技術(shù)，可以鑒別正常個(gè)體、前突變、全突變男性及全突變女性。由于PCR技術(shù)優(yōu)先擴(kuò)增較小片段的等位基因，因此對于呈嵌合型的患者，也會產(chǎn)生PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，易于產(chǎn)生假陰性。PCR技術(shù)是快速篩查脆性X綜合征的基因診斷方案。難以擴(kuò)增出全突變的等位基因，因此限制了它對于脆性X綜合征患者臨床診斷方面的應(yīng)用，PCR技術(shù)和Sothernblot技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，可以彌補(bǔ)相互之間的缺陷。第十三頁，共31頁。1．4逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

絕大多數(shù)FXS征男性患者無FMR1基因的表達(dá)，而女性患者的FMR1基因是雜合的，F(xiàn)MR1基因表達(dá)降低，但可檢測到。所以RT-PCR在男性患者、缺失或點(diǎn)突變的個(gè)體是檢測不到擴(kuò)增引物，而對于正常個(gè)體、前突變及女性可以獲得擴(kuò)增條帶。HmadchaA等用RT-PCR方法檢測該FMR1基因的表達(dá)。WuLQ等設(shè)計(jì)合成了2對特異性引物檢測位于X染色體上的HPRT基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，通過巢式PCR技術(shù)對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增、檢測。有助于FRAX患者的診斷及表型的預(yù)測，對于遺傳咨詢有較大的幫助，不能鑒別女性患者及檢測前突變狀態(tài)，從而應(yīng)用有限。第十四頁，共31頁。1．5FMRP免疫組化分析

應(yīng)用此方法檢測FMRP的表達(dá)量。可診斷由于（CGG）n的擴(kuò)增導(dǎo)致的脆性X綜合征患者，及檢出由于缺失、點(diǎn)突變導(dǎo)致FMR1基因不表達(dá)的患者，同時(shí)簡便、經(jīng)濟(jì)、快速，適用于群體篩查，其敏感性100%，特異性97.5%。但由于女性患者體內(nèi)有一定比例的活性X染色體，且具有全突變的等位基因多位于失活的X染色體，大多數(shù)淋巴細(xì)胞的FMRP降低不明顯，易于形成假陰性，且由于前突變等位基因能正常轉(zhuǎn)錄，F(xiàn)MRP表達(dá)多在正常范圍內(nèi)，亦不適用于前突變攜帶者的篩查，因此僅適用于男性患者的診斷。RifeM等比較了PCR和FMRP免疫組化檢測在人群篩檢方面的差別，認(rèn)為PCR是最合適、方便、省時(shí)的方法。但對于那些PCR檢測失敗的患者，推薦應(yīng)用該方法。第十五頁，共31頁。1．6產(chǎn)前診斷

2005年ACMG指南建議妊娠10-12周的FXS攜帶者婦女用絨毛膜絨毛標(biāo)本，可顯示前突變。CVS細(xì)胞不同于外周血細(xì)胞，它不存在甲基化的X染色體失活，全突變的FMR1基因5`-UTR的三核苷酸（CGG）n重復(fù)序列甲基化也可有可無。利用FMR1基因甲基化和X染色體失活診斷全突變有失準(zhǔn)確性。若CVS結(jié)果陽性，應(yīng)于妊娠15周抽取羊水細(xì)胞排除全突變和嵌合體狀態(tài)。第十六頁，共31頁。2FXS治療新進(jìn)展

目前無有效的治療方法。近來在FXS的治療中最明顯的進(jìn)步就是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中認(rèn)識到了FXS潛在的缺陷和發(fā)展了的可能的治療。第十七頁，共31頁。2、1一般治療葉酸可以“修復(fù)”FXS細(xì)胞傳代時(shí)的脆性位點(diǎn),使FMR基因表達(dá)功能正常的FMRP,改善智力狀況。同時(shí)還可予維生素C、維生素E、微量元素鋅、硒等。智低者營養(yǎng)腦細(xì)胞,茴拉西坦、吡拉西坦、胞二磷膽堿等可改善癥狀。癲癇可按發(fā)作類型正規(guī)抗癲癇治療。中醫(yī)中藥療法,應(yīng)用加味六味地黃丸培補(bǔ)腎元,針灸推拿促進(jìn)智力發(fā)育,改善小兒癡呆。治療效果與患兒年齡和原發(fā)神經(jīng)疾病有關(guān)。16歲智低和癡呆患兒年齡較大效果不佳,癲癇患兒服藥不規(guī)范控制不良。第十八頁，共31頁。2、2真對于FMRP表達(dá)減少的治療2、2、1針對FMR1的基因治療FMR1突變導(dǎo)致FMRP減少引起FXS的發(fā)生，F(xiàn)MRP是一種mRNA綁定蛋白，其在中樞mRNA翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)及靶向作用中起重要作用。FMRP負(fù)相調(diào)控mRNA翻譯為蛋白質(zhì).Rattazzi等提出基因治療的可能性，通過給Fmr1KO小鼠注射一種小的、可擴(kuò)散的帶有FMR1cDNA基因的腺伴隨病毒，此病毒包含5'啟動(dòng)子區(qū)和3'非翻譯區(qū)的基因，通過滲透作用通過血腦屏障，從而傳遞Fmr1cDNA進(jìn)入大腦。Musumeci等發(fā)現(xiàn)在Fmr1KO小鼠予以人類FMR1基因和FMR1cDNA治療，和野生型FMR1小鼠比較聽源性癲癇的易感性，由于聽源性癲癇具有年齡易感性，所以在不同的年齡檢測，發(fā)現(xiàn)聽源性癲癇在6個(gè)月大的小鼠可以完全治愈，而在成年小鼠僅可部分治愈。第十九頁，共31頁。2、2、2FMRP蛋白的添加治療

最近文獻(xiàn)報(bào)道：蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)大分子蛋白進(jìn)入細(xì)胞甚至進(jìn)入大腦。來自人免疫缺陷癥病毒的A蛋白：Tat–FMRP融合蛋白，利用腹腔注射可以傳遞大分子進(jìn)入細(xì)胞并通過血-腦屏障。置入FXS成纖維細(xì)胞和FmrKO小鼠的初級培養(yǎng)物神經(jīng)元，F(xiàn)MRP蛋白的攝取效率和水平在神經(jīng)元比期望的要低的多。第二十頁，共31頁。另外，F(xiàn)MRP蛋白是否有毒被質(zhì)疑。同時(shí)運(yùn)用免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)運(yùn)用轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白介導(dǎo)的FMRP在成纖維細(xì)胞中攝取的效率和速率比預(yù)想的低，神經(jīng)元攝取率更低。同時(shí)FMRP的濃度也需要嚴(yán)格控制，超過生理水平或較高水平可能導(dǎo)致mRNAs的不適當(dāng)?shù)姆g，F(xiàn)MRP轉(zhuǎn)基因的過度表達(dá)在FmrKO小鼠導(dǎo)致嚴(yán)重的行為異常甚至有害的作用。同時(shí)FMRP精確的表達(dá)需要技術(shù)的引入。第二十一頁，共31頁?，F(xiàn)在基因治療可能不是FXS治療最好的方法.人類脆性X染色體相關(guān)基因FMR基因包括FXR1基因和FXR2基因。分別定位于X.q27.3，3q28和17p13.1。它們分別翻譯蛋白FMRP,FXR1P和FXR2P，這三種蛋白主要存在于細(xì)胞漿中在脊椎動(dòng)物中表達(dá)廣泛，F(xiàn)MRP在大腦和睪丸中表達(dá)最高，F(xiàn)XR1P主要在于橫紋肌表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)FMRP和FXR2P在橫紋肌中表達(dá)，至今還沒有發(fā)現(xiàn)FXR1和FXR2與任何病理缺陷相關(guān)。但由于由于FMR1基因突變導(dǎo)致其編碼的FMRP蛋白減少導(dǎo)致FXS，同時(shí)FXR1P和FXR2P是否會在由于FMR1突變導(dǎo)致的FXS中起到補(bǔ)償作用，至少部分補(bǔ)償，至今還是一個(gè)未知話題。第二十二頁，共31頁。2、3L型Ca2+通道阻滯劑的治療作用

FMRP蛋白與mRNAs的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)，靶mRNAs水平在FXS腦區(qū)沒有改變，但是由靶mRNAs轉(zhuǎn)錄的蛋白L-型Ca2+通道亞單位和MAP1B在特殊腦區(qū)下調(diào)，提示FXS靶編碼蛋白的表達(dá)有缺陷。L-型Ca2+通道參加記憶突觸的形成。2003年Veng等發(fā)現(xiàn)Ca2+通過L-型電壓敏感Ca2+通道增加造成成年小鼠的海馬CA1區(qū)的Ca2+增加，通過L-型Ca2+通道的Ca2+注入可能對記憶的形成有害。利用L-型電壓敏感Ca2+通道拮抗劑尼莫地平長期治療與年齡相關(guān)的操作記憶缺陷和海馬a蛋白的增高，尼莫地平可改善年齡相關(guān)的操作記憶缺陷和降低海馬a蛋白的表達(dá)。海馬CA1區(qū)與年齡相關(guān)的操作記憶減退及a蛋白的增加與記憶缺陷相關(guān)。其中年齡可能起到重要的作用在記憶減退的形成中。第二十三頁，共31頁。2、4親代謝性谷氨酸鹽受體5(metabotropicglutamatereceptor5,mGluR5)拮抗劑的應(yīng)用mGlu5受體主要在皮質(zhì)、髓紋、海馬、小腦表達(dá)。mGluR5激動(dòng)劑能使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生脆性X綜合征相似的病理改變和臨床癥狀。mGluR5抑制劑能夠部分逆轉(zhuǎn)脆性X綜合征模型動(dòng)物的異常行為。提示mGluR5信號的過度活動(dòng)可能參與脆性X綜合征的發(fā)病。FMRP是一種mRNA結(jié)合蛋白,可作為翻譯抑制因子負(fù)性調(diào)節(jié)突觸后膜mRNA的翻譯和表達(dá)。因此推測FMRP缺乏和減少可能導(dǎo)致mGluR5激發(fā)的mRNA翻譯增多,參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的蛋白過度表達(dá)及影響樹突棘的發(fā)育。第二十四頁，共31頁。最近的研究表明在培養(yǎng)的普通大鼠海馬神經(jīng)元中加入mGLUR5激動(dòng)劑DHPG,樹突棘表現(xiàn)出類似FMR1KO小鼠的形態(tài)異常。利用mGLUR5抑制劑：如2-甲基-6-苯基嘧啶（2-methyl-6-(phenylethynyl)pyridineMPEP）治療、較低濃度的MPEP和另外幾種不同的mGluR拮抗劑分別用于減低mGluR活性，可回復(fù)FXS模型的先天的求偶行為.Parnass等報(bào)道MPEP可使樹突棘的形態(tài)在適當(dāng)外界干預(yù)的條件下數(shù)分鐘內(nèi)就發(fā)生改變。MPEP可以改善FMR1KO小鼠的激越癥狀：癲癇和焦慮。及孤獨(dú)癥。也許還可以改善認(rèn)知障礙。第二十五頁，共31頁。2、5糖原合成酶激酶-3（glycogensynthasekinase-3GSK3）抑制劑的應(yīng)用

并用mGluR5拮抗劑和GSK3抑制劑沒有壘加作用。相反表現(xiàn)為它們的同步激活，用于抑制mGluR5的同時(shí)也導(dǎo)致了GSK3的抑制.推測GSK3可能是FXS病理學(xué)的一個(gè)基本的中間步驟。具有重要的治療可能性[29]。FMR1KO小鼠GSK3活性的增高為FXS治療提供了可能的代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部位。GSK3是一種普遍存在的絲氨酸-蘇氨酸激酶,在哺乳動(dòng)物具有GSK3和GSK3兩種亞型，在許多細(xì)胞中GSK3對基因表達(dá)、細(xì)胞構(gòu)建和程序性死亡具有重要的調(diào)節(jié)作用。由于許多細(xì)胞功能受都GSK3的影響,因此要求其活性需要精密的調(diào)節(jié)。GSK3活性最重要的調(diào)節(jié)機(jī)制為絲氨酸-21和絲氨酸-9的磷酸化,由此大大抑制GSK3的活性。第二十六頁，共31頁。FMR1KO小鼠的大腦的幾個(gè)區(qū)域發(fā)現(xiàn)重要的中樞代謝調(diào)節(jié)酶GSK3出現(xiàn)過度激活，GSK3抑制劑鋰鹽可以恢復(fù)FSX小鼠突變體表型。例如鋰鹽可以抑制聽原性癲癇的發(fā)作。鋰鹽為一種抗精神病藥，主要用于治療情感障礙，可以抑制GSK3，而對其他蛋白無影響。并且它的使用與年齡關(guān)系不大，即使出生后一個(gè)月開始用藥，一旦停藥癥狀就會復(fù)發(fā)。這與mGluR5拮抗劑MPEP不同。優(yōu)點(diǎn)在于人們對鋰鹽的應(yīng)用史較長，積累的經(jīng)驗(yàn)豐富，價(jià)格低廉，容易獲得。但鋰鹽容易導(dǎo)致肥胖，且孕婦和哺乳婦女應(yīng)用可導(dǎo)致嬰兒中毒。第二十七頁，共31頁。2、6中藥治療由于目前