谷氨酸的發(fā)酵工藝

谷氨酸的發(fā)酵工藝第1頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四

味精的產(chǎn)品特性商品味精味精的安全性正確食用味精的方法第2頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四中國味精業(yè)空間巨大2001年東南亞地區(qū)味精人均消費量：臺灣：2000克韓國：1200克日本：1020克香港：1000克中國大陸：500克中國味精消費每年至少有160萬噸的空間第3頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四原料的預處理及淀粉水解糖的制取谷氨酸生產(chǎn)菌種子的擴大培養(yǎng)谷氨酸發(fā)酵谷氨酸的提取與分離由谷氨酸制成味精及味精成品加工

味精生產(chǎn)工藝流程第4頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四味精的發(fā)酵工藝主要內(nèi)容：第一節(jié)：谷氨酸生產(chǎn)第二節(jié)：谷氨酸的提取第三節(jié)：谷氨酸制味精第5頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)谷氨酸生產(chǎn)概述：氨基酸發(fā)酵一.谷氨酸生產(chǎn)原料及其處理二.谷氨酸產(chǎn)生菌三.谷氨酸的合成途徑四、谷氨酸代謝的調控五.谷氨酸的發(fā)酵工藝第6頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四概述氨基酸發(fā)酵1.氨基酸的作用：組成蛋白質的基本成分；可作為調味料；提高食品的營養(yǎng)價值。生產(chǎn)氨基酸的大國為日本和德國。第7頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四2.氨基酸生產(chǎn)方法發(fā)酵法化學合成法酶法抽提法第8頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四3.氨基酸發(fā)酵概念：利用微生物生長和代謝活動生產(chǎn)各種氨基酸作用的過程。原料氨基酸其他代謝產(chǎn)物氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵，它的積累是建立在對微生物正常代謝的抑制上。關鍵：能否打破微生物的正常代謝調節(jié)，人為的控制發(fā)酵。

微生物微生物（中間代謝產(chǎn)物）第9頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四一、谷氨酸生產(chǎn)原料及其處理

谷氨酸的作用：（1）合成人體代謝所需的其他氨基酸。（2）降低血液中氨中毒作用。（3）參與腦蛋白代謝和糖代謝。

腦組織只能氧化谷氨酸，而不能氧化其他氨基酸。（4）對于防治腦震蕩或腦神經(jīng)損傷有一定的療效。

長期適當?shù)姆霉劝彼幔商岣呱窠?jīng)有缺陷兒童的智力。（5）生產(chǎn)味精，作重要的調味品。第10頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四谷氨酸發(fā)酵的主要原料

淀粉：玉米、小麥、甘薯、大米等，其中甘薯的淀粉最為常用。糖蜜：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜醋酸乙醇正烷烴（液體石蠟）氮源料：尿素或氨水。第11頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四

國內(nèi)：淀粉（多數(shù)廠家）

糖蜜（少數(shù)廠家）

淀粉

水解葡萄糖谷氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸糖蜜

預處理去除生物素的糖蜜

谷氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸第12頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（一）糖蜜的預處理原因：糖蜜（特別是甘蔗糖蜜）中含有過量的生物素，會導致光長菌體，不產(chǎn)谷氨酸的后果，影響谷氨酸的積累。目的：降低生物素的含量方法：1.活性炭處理法：吸附2.水解活性炭處理法：用鹽酸水解糖蜜后再吸附3.樹脂處理法：通過脫色樹脂交換柱第13頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（二）淀粉的糖化淀粉水解葡萄糖酸解法酶解法酸酶（或酶酸）結合法酸酶法酶酸法第14頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四淀粉糖化的方法1.酸解法淀粉酸高溫高壓葡萄糖2.酶解法（雙酶法）淀粉a-淀粉酶糊精和低聚糖糖化酶葡萄糖(液化)（糖化）3.酸酶法淀粉酸解法糊精和低聚糖糖化酶葡萄糖4.酶酸法淀粉a-淀粉酶糊精和低聚糖酸解法葡萄糖第15頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四二、谷氨酸產(chǎn)生菌

1.種類：谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、嗜氨小桿菌、硫殖短桿菌。我國使用的生產(chǎn)菌株是北京棒桿菌AS1.299、北京棒桿菌D110、鈍齒棒桿菌AS1.542、棒桿菌S-914和黃色短桿菌T6~13等。谷氨酸棒桿菌呈一端膨大的棒狀，折斷分裂形成“八”字狀排列第16頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四2.形態(tài)上共同特點（芽孢桿菌除外）:（1）革蘭氏陽性（2）菌體為球形、短桿至棒狀（3）不形成芽孢（4）沒有鞭毛，不能運動（5）都是生物素缺陷型（6）都是需氧型微生物第17頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四三、谷氨酸合成途徑1.谷氨酸合成的方式（1）氨基轉移作用-酮戊二酸+氨基酸谷氨酸+-酮酸（2）還原氨基化作用-酮戊二酸+NH4++NADPH2

谷氨酸+NADPH+H2O第18頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四2、谷氨酸合成途徑

谷氨酸的生物合成過程中的幾個途徑主要有：（1）糖酵解途徑（EMP途徑）（2）磷酸己糖途徑（HMP途徑）（3）三羧酸循環(huán)途徑（TCA循環(huán)）（4）乙醛酸循環(huán)途徑（DCA循環(huán)）（5）伍德-沃克反應（CO2固定反應）（6）α-酮戊二酸的還原氨基化反應這6條途徑之間是相互聯(lián)系和相互制約的，如圖所示：第19頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四葡萄糖

②HMP3-磷酸甘油醛丙酮酸乙酰輔酶ACO2草酰乙酸檸檬酸蘋果酸異檸檬酸延胡索酸琥珀酸NADPHα-酮戊二酸NADPHNH4+谷氨酸乳酸乙酰輔酶A④乙醛酸循環(huán)乙醛酸①EMP③TCA谷氨酸⑤CO2固定透過細胞膜⑥α-酮戊二酸的還原氨基化3.谷氨酸的生物合成過程中的幾個途徑第20頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四三羧酸循環(huán)（TCA）第21頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四4.谷氨酸產(chǎn)生菌的生化特征（1）CO2固定能力強。（2）-酮戊二酸氧化能力微弱:-酮戊二酸脫氫酶喪失或活性低。（3）異檸檬酸裂解酶活力微弱。（4）谷氨酸脫氫酶活性強。（5）還原性輔酶Ⅱ(NADPH+H+)進入呼吸鏈能力缺陷或微弱。（6）不利用谷氨酸。（7）耐高糖耐高谷氨酸。（8）解除谷氨酸反饋抑制。（9）具有向胞外分泌谷氨酸的能力。第22頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四谷氨酸理論轉化率如果草酰乙酸全部由CO2固定獲得，則1摩爾葡萄糖生成1摩爾的谷氨酸。C6H12O6+NH3+1.5O2→C5H9O4+CO2+3H2O理論轉化率=147/180=81.7%第23頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四谷氨酸的大量積累不是由于生物合成途徑的特異，而是：（一）菌體代謝調節(jié)控制（二）細胞膜通透性的特異調節(jié)（三）發(fā)酵條件的適合四、谷氨酸代謝的調控第24頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（一）菌體代謝調節(jié)控制

1.谷氨酸生物合成的調節(jié)機制琥珀酸-酮戊二酸脫氫酶（弱）

-酮戊二酸

谷氨酸脫氫酶（強）谷氨酸透過細胞膜谷氨酸第25頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四谷氨酸生物合成的調節(jié)機制1.優(yōu)先合成與反饋調節(jié)2.糖代謝的調節(jié)（1）能荷控制（2）能荷控制生物素對糖代謝的調節(jié)3.氮代謝的調節(jié)4.其他調節(jié)（如Cu2+的調節(jié)）第26頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（二）細胞膜通透性的特異調節(jié)用能積累谷氨酸菌株做如下實驗:生物素充足時,細胞內(nèi)含大量谷氨酸,但培養(yǎng)液里幾乎不含谷氨酸用溶菌酶消化細胞壁得到的原生質體仍不分泌谷氨酸當把原生質體放入低滲溶液里,將其漲破,谷氨酸才排出生物素亞適量時,培養(yǎng)液里含大量谷氨酸,細胞里含量少結論:谷氨酸的分泌是由細胞膜控制第27頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四控制細胞膜通透性的方法：控制磷脂的合成；控制細胞壁的合成：選育溫敏突變株

第28頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四1.控制磷脂的合成

①生物素營養(yǎng)缺陷型作用機制:生物素是脂肪酸生物合成最初反應的關鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶,參與了脂肪酸的合成,進而影響脂肪酸的合成。當磷脂合成量少到正常的1/2左右時,細胞變形,Glu向膜外漏出，積累于發(fā)酵液中。控制關鍵:使用該類突變株必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素亞適量(5-10g/L).在發(fā)酵初期(0-8小時),細胞正常生長,當生物素耗盡后,在菌的再次倍增時,開始出現(xiàn)異常形態(tài)細胞,即完成了細胞從生長型到積累型轉換.突變株第29頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四

②油酸營養(yǎng)缺陷型作用機制:油酸營養(yǎng)缺陷型喪失了合成油酸的能力,通過控制油酸使磷脂合成量減少到正常量的1/2左右.控制關鍵:保證在培養(yǎng)基中油酸亞適量,完成細胞從生長型到生產(chǎn)型的轉換.突變株第30頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四③甘油缺陷型作用機理：喪失L-甘油-3-磷酸(NADP氧化還原酶)，不能合成a-磷酸甘油和磷脂，只有添加甘油才能生長。在甘油限量供應下，由于控制了細胞膜中與滲透性有直接關系的磷脂的含量，使谷氨酸得以積累?？刂频年P鍵：添加亞適量的甘油或甘油衍生物。甘油過少，菌株生長不夠好;甘油過量，磷脂合成正常，產(chǎn)谷氨酸低。突變株第31頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四添加表面活性劑(如吐溫60)或不飽和脂肪酸(C16-18),也能造成細胞滲漏,積累谷氨酸。機理:兩者在脂肪酸合成時對生物素有拮抗作用,導致磷脂合成不足,形成不完整的細胞膜。關鍵:控制好脂肪酸或表面活性劑的時間和濃度,必須在藥劑加入后,在這些藥劑存在下進行分裂,形成產(chǎn)酸型細胞。其他④添加表面活性劑第32頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四⑤添加青霉素機理:青霉素抑制谷氨酸生產(chǎn)菌細胞壁后期的合成,細胞膜在失去保護,在滲透壓的作用下受損,向外泄露谷氨酸.控制關鍵:一般在進入對數(shù)生長期的早期(3-6小時)添加.添加青霉素后倍增的菌體不能合成完整的細胞壁,完成細胞功能的轉換.

其他第33頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四谷氨酸發(fā)酵強制控制工藝如:“高生物素高吐溫”或“高生物素高青霉素”控制方法:在發(fā)酵培養(yǎng)基中預先配加一定量(過量)的純生物素,大大地削弱每批原料中生物素含量變化的影響,高生物素大接種量能促進菌體迅速增殖.再在菌體倍增的早期加入相對高的吐溫或青霉素,形成產(chǎn)酸型細胞.固定其它條件,確保高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn).其他第34頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（三）發(fā)酵條件的控制

（1）發(fā)酵溫度谷氨酸發(fā)酵前期(0~12h):30-32℃。對數(shù)生長期:菌體濃度迅速增大（12h），糖耗快，維持溫度30-32℃在發(fā)酵中、后期:是谷氨酸大量積累的階段，而催化谷氨酸合成的谷氨酸脫氫酶的最適溫度在32-36℃。

第35頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（2）

pH值1）pH值對谷氨酸產(chǎn)生菌生長的影響2）pH值對谷氨酸積累的影響發(fā)酵液的pH影響微生物的生長和代謝途徑。發(fā)酵前期如果pH偏低，則菌體生長旺盛，長菌而不產(chǎn)酸；如果pH偏高，則菌體生長緩慢，發(fā)酵時間拉長。在發(fā)酵前期將pH值控制在7.5~8.0左右較為合適。而在發(fā)酵中、后期將pH值控制在7.0~7.6左右對提高谷氨酸產(chǎn)量有利。第36頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（3）通風在谷氨酸發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期以低通風量為宜；發(fā)酵中、后期以高通風量為宜。實際生產(chǎn)上，以氣體轉子流量計來檢查通氣量，即以每分鐘單位體積的通氣量表示通風強度。另外發(fā)酵罐大小不同，所需攪拌轉速與通風量也不同。

第37頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（4）

泡沫的控制在發(fā)酵過程中由于強烈的通風和菌體代謝產(chǎn)生的CO2，使培養(yǎng)液產(chǎn)生大量的泡沫，不僅使氧在發(fā)酵液中的擴散受阻，影響菌體的呼吸和代謝。給發(fā)酵帶來危害，必須加以消泡。消泡方法：機械消泡(耙式、離心式、刮板式、蝶式消泡器)化學消泡(天然油脂、聚酯類、醇類、硅酮等)第38頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四（5）

發(fā)酵時間不同的谷氨酸產(chǎn)生菌對糖的濃度要求也不一樣，其發(fā)酵時間也有所差異。低糖(10%~12%)發(fā)酵，其發(fā)酵時間為36~38h，中糖(14%)發(fā)酵，其發(fā)酵時間為45h。第39頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四五、谷氨酸發(fā)酵工藝整個過程可簡單的分為2個階段:1.菌體生長階段;2.產(chǎn)酸階段,谷氨酸得以大量積累。

第40頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵過程參數(shù)測定還原糖的測定谷氨酸的測定菌體形態(tài)觀察菌體濃度測定發(fā)酵過程參數(shù)的控制OD值pH溫度攪拌速度發(fā)酵發(fā)酵液冷卻接種三角瓶培養(yǎng)固體斜面培養(yǎng)上罐實消培養(yǎng)基的配制谷氨酸發(fā)酵的工藝流程簡圖第41頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四1.發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分（1）碳源（2）氮源（3）無機鹽（4）生長因子第42頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四2.培養(yǎng)基滅菌（1）滅菌條件實罐培養(yǎng)基滅菌條件：105~110℃，滅菌5min連續(xù)滅菌條件：連消塔滅菌溫度為110~115℃,維持罐溫度在105~110℃約6min。（2）冷卻：至30℃左右。第43頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四3.種子的擴大培養(yǎng)接種量：1%兩級擴大培養(yǎng)的方法，其工藝流程為：保藏菌種斜面活化

搖瓶種子培養(yǎng)（一級種子）種子罐（二級種子）發(fā)酵罐第44頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四谷氨酸發(fā)酵過程中,生產(chǎn)菌種的特性、生物素、發(fā)酵溫度、pH值、通風和發(fā)酵產(chǎn)生的泡沫都是影響谷氨酸積累的主要因素。在實際生產(chǎn)中,只有針對存在的問題,嚴格控制工藝條件,才能達到穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的目的。第45頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四將谷氨酸發(fā)酵菌在發(fā)酵液中積累的L-谷氨酸提取處理，再進一步中和、除鐵、脫色加工精制成谷氨酸單鈉鹽（俗稱味精），這個過程叫提煉。從生產(chǎn)上分為谷氨酸提取與精制兩個階段。第二節(jié)谷氨酸的提取第46頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四目前國內(nèi)各味精廠提取谷氨酸的主要方法：1.等電點法2.離子交換法3.金屬鹽法4.鹽酸水解等電電法5.離子交換膜電滲析法國外提取谷氨酸方法：日本：協(xié)和發(fā)酵采用濃縮等電點工藝美國：旋轉真空膜過濾第47頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四谷氨酸發(fā)酵液常溫等電法等電結晶沉降分離脫色中和結晶冷凍等電法上清液（母液）離子交換谷氨酸晶體谷氨酸晶體冷凍結晶濃縮結晶谷氨酸鈉晶體（味精）谷氨酸的分離與味精的制備

第48頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四一、等電點法提取谷氨酸(簡單、常用)原理：HOOC—CH2—CH2—CH(NH2)—COOH谷氨酸（GA）HOOC—CH2—CH2—CH(NH3+)—COOHGA+HOOC—CH2—CH2—CH(NH3+)—COO-

GA士HOOC—CH2—CH2—CH(NH2)—COO-

GA--OOC—CH2—CH2—CH(NH2)—COO-

GA=

谷氨酸在等電點是它呈電中性時所處的環(huán)境的PH值，用PI表示。谷氨酸在等電點時,絕大部分以偶極離子(GA±)狀態(tài)存在,其分子內(nèi)部正負電荷相等,并含有等量的帶不同電荷的陽離子(GA+)和陰離子(GA-),因此溶液中總靜電荷等于零。由于谷氨酸分子之間相互碰撞,再通過靜電引力的作用,結合成較大的聚合體而被沉淀析出,因而處于等電點時GA的溶解度最小。又由于溫度對GA的溶解度影響很大,溫度越低溶解度越小,生產(chǎn)上多采用0～4℃。第49頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四等電點法提取工藝

操作簡單，收率60％。周期長，占地面積大20BeHClpH4.5~4.02h慢加酸發(fā)酵液第一中和點停酸育晶等電點pH5.0時慢加

pH3.0~3.2低速攪拌結晶靜止沉降濕谷氨酸離心分離谷氨酸20h母液第50頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四等電點法提取谷氨酸注意三個方面：發(fā)酵液純度高：谷氨酸/殘?zhí)潜戎蹈?，膠體少，提前除菌體最好；發(fā)酵液處理要及時；加酸調pH、溫度、育晶時間、攪拌服從結晶規(guī)律。第51頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四原理：當氨基酸pH值大于3.22時羧基離解而帶負電,它能被陰離子交換樹脂吸附;當pH小于3.22時氨