肝臟蛋白的提取和濃度測定

肝臟蛋白的提取和濃度測定第1頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四實驗?zāi)康牧私獠⒄莆盏鞍踪|(zhì)的提取方法了解掌握考馬斯亮藍法（Braford法）測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法第2頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四實驗內(nèi)容實驗?zāi)康摹舾闻K組織蛋白的提取◆蛋白的濃度測定第3頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四

原理：

RIPA裂解液是一種傳統(tǒng)的細胞組織快速裂解液，主要裂解成分含1%TritonX-100,0.5%膽氧膽酸鈉（sodiumdeoxycholate）,0.1%SDS，得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western。1.肝臟組織的提取第4頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四操作步驟超聲勻漿冰上放置4度離心吸取上清1.肝臟組織的提取組織取材第5頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四1.肝臟組織的提取

（1）組織取材：

取約100mg大鼠肝臟組織，用滅菌的剪刀將組織塊盡量剪碎，放入1.5ml滅菌的EP管中

第6頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四1.肝臟組織的提取

（2）超聲勻漿：

加0.5mlRIPA裂解液（含50ulPMSF）,置于冰上，用超聲勻漿器進行勻漿,超聲每次10秒，重復(fù)3次第7頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四1.肝臟組織的提取

（3）冰上放置：

裂解完全后，冰上放置30分鐘第8頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四1.肝臟組織的提取

（4）4度離心：

放入離心機中，4℃12000rpm離心5min

第9頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四1.肝臟組織的提取

（5）吸取上清：

取上清分裝于0.2ml離心管中并置于－20℃保存，待用第10頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四超聲勻漿要保持低溫超聲強度以不產(chǎn)生泡沫為準注意事項第11頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四2.蛋白的濃度測定考馬斯亮藍法BCA法紫外吸收法Lowry法(Folin-酚試劑法)雙縮脲法第12頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四第13頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四2.蛋白的濃度測定-考馬斯亮藍法1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用?？捡R斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性，考馬斯亮蘭G-250的最大光吸收峰在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm。在595nm下，光密度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)含量的測定。第14頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四15實驗步驟空白管標準管測定管

01234561mg/mL牛血清白蛋白溶液蒸餾水待測樣品考馬斯亮藍G25000.20.40.60.81.001.00.80.60.40.200––––––15555555管號試劑(ml)1.取試管7支，編號，按下表加入試劑:2.

混勻,

室溫放置2min。在波長

595nm

處以0號管調(diào)零，測定各管吸光度值。第15頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四16

以標準液的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。C（蛋白濃度）A（吸光度）Axcx

繪制標準曲線：0.20.40.60.81.0mg/mLOD第16頁，共18頁，2023年，2月20日，星期四實驗內(nèi)容◆腎臟蛋白