第十二講蛋白質分子設計

一、蛋白質分子設計的概念和意義1、概念實現(xiàn)蛋白質分子改造目標的一整套方法、計劃、措施和指導方針。以蛋白質結構和功能的關系為基礎，通過蛋白質模型和結構預測等方法，構建具有新功能的蛋白質模型的技術。如何理解？分子設計包括：目標、思想、程序、方法、措施、驗證和分析一系列過程。是藍圖—如：建筑工程的設計藍圖—宏偉構思和誘人的前景是理論—理論上的設計——指導實踐過程是實踐—實踐上的驗證——提出問題與建筑工程的藍圖不同——實施驗收(也有豆腐渣工程——不是設計的問題)是設計—實踐—驗證—再設計—再實踐—再驗證的過程是一個設計—驗證反復進行的過程。獲得新功能蛋白質分子及其分子模型2、意義：（通過分子設計、人工改造蛋白）理論上：解析蛋白質結構和功能關系實踐上：滿足生產實踐的需求目前一頁\總數(shù)三十頁\編于十七點蛋白質分子設計是蛋白質工程領域的核心問題與前沿領域是一門新興的研究領域，是眾多學科的交叉結構生物學、信息生物學、分子生物學、蛋白質化學、細胞生物學、免疫學等隨其他學科的發(fā)展而不斷地發(fā)展，其內容也在不斷地更新。設計和實踐成功的實例：DNA結合蛋白、血紅素結合蛋白、氧化還原活性蛋白理論上：解析蛋白質結構和功能關系？為什么組成天然蛋白質只20種氨基酸， 卻具有高度多樣性，功能如此廣泛又各不相同？？蛋白質一級結構與高級結構的關系？？蛋白質高級結構與功能的關系？？蛋白質一級結構與功能的關系？2、意義——理論上：目前二頁\總數(shù)三十頁\編于十七點天然蛋白的缺陷生物進化過程中，自然選擇了數(shù)量眾多、種類各異的天然蛋白質。天然蛋白質在特定的條件下應用，(適合于生物環(huán)境)改造蛋白的優(yōu)勢工業(yè)生產—高溫高壓條件，其結構和功能改變，達不到理想的效果。 為了更好地發(fā)揮蛋白質的作用，需要對蛋白質進行人為改造。如：藥物、食品工業(yè)和污水處理中的酶、疫苗、生物傳感器等進行蛋白分子設計改造，發(fā)揮良好的作用。如：經改造穩(wěn)定性好的酶，可從價格便宜的棕櫚油中生產出價格昂貴的可可脂，創(chuàng)造很高的經濟效益。2、意義——實踐上：目前三頁\總數(shù)三十頁\編于十七點如：荷蘭一家公司設計了一種與漂白劑一同起作用的去污酶（對酶上兩個氨基酸修改，使這種酶具有較高抵抗力），在洗滌過程中不受破壞。如：醫(yī)學上，蛋白質工程也具有廣泛的應用前景。比如，用人工手段去改造蛋白質，開辟了診斷和治療癌癥的新途徑。 單鏈抗體—核素——免疫影像？ 單鏈抗體—毒素——免疫治療？我國的蛋白質工程達到國際先進水平，如：重組人胰島素和溶血栓藥物、重組人尿激酶等。對這些蛋白質改造離不開蛋白質分子設計。因此，蛋白質分子設計在生產實踐中具有重要意義目前四頁\總數(shù)三十頁\編于十七點二、蛋白質設計的分類包括兩種分類方式1、根據對蛋白質改造的程度分為三類第一類為“小改”，即通過定位突變或化學修飾來實現(xiàn)；第二類為“中改”，即不同蛋白質的結構域進行拼接組裝，改變蛋白質的功能特性的方法；——如：蛋白質融合技術實現(xiàn)第三類為“大改”，即全新設計具有特定功能的蛋白質——仿生2、根據改造對象分為兩類基于天然蛋白質結構的分子設計全新蛋白質的分子設計3、兩種分類方法是統(tǒng)一的目前五頁\總數(shù)三十頁\編于十七點三、蛋白質設計的基礎理解（一級結構—高級結構—功能的關系）——蛋白質分子設計的基礎理解結構是功能的基礎——蛋白質獨特的性質和功能是其特定結構的反映。1、蛋白質一級結構是空間結構的基礎（理解2點）每一種天然蛋白質生物學活性，決定于蛋白質的結構特點20種aa各具特殊的側鏈，側鏈基團的理化性質和空間排布各不相同，可形成多種多樣的空間結構，具有不同生物學活性。一級結構不同，蛋白質功能和活性存在差異，甚至完全不同。每種蛋白質具有特定的結構，執(zhí)行其特定的功能甚至一級結構上個別aa變化→特定功能的喪失或改變。最經典的例子：鐮刀型紅細胞貧血病，即患者Hb2條β鏈第6位Glu→Val蛋白酶：個別aa突變（關鍵aa），酶活性喪失*要求：查找一級結構中個別氨基酸突變蛋白，功能改變的實例目前六頁\總數(shù)三十頁\編于十七點2、蛋白質空間結構直接決定蛋白質的功能一級結構不能完全了解蛋白質分子的生物學活性和理化性質多肽鏈并非呈線形伸展，而是折疊和盤曲構成特有的穩(wěn)定的空間結構蛋白質的生物學活性和理化性質主要決定于空間結構的完整性 ？去折疊——變性，一級結構未發(fā)生改變—功能完全喪失—空間結構的作用 ？蛋白質去折疊的方法——物理、化學因子蛋白的性質和功能，很難僅用蛋白質的一級結構的排列順序來解釋理解蛋白空間結構和功能關系對蛋白質分子設計才是最重要的蛋白質一級結構——高級結構——功能關系，是蛋白質分子設計的基礎目前七頁\總數(shù)三十頁\編于十七點蛋白質分子設計面臨的挑戰(zhàn)雖然解析蛋白質的結構逐年增加，但依然無法滿足蛋白質分子設計的需要？現(xiàn)有蛋白質的分子設計大多數(shù)主要依據一級結構。——一次性成功的把握很??？目前八頁\總數(shù)三十頁\編于十七點四、蛋白質分子設計的流程蛋白質分子設計——龐大工程蛋白質分子設計程序構建原蛋白質模型建立和優(yōu)化突變體模型獲得蛋白質的突變體結構和功能分析驗證新的結構和功能的蛋白質通常，需要幾次循環(huán)才能達到目的蛋白質分子設計流程需要計算機專家、X射線晶體學家、蛋白質化學家、生物技術專家相互配合需要理論設計和試驗過程相結合，才能達到改造蛋白質的目的。目前九頁\總數(shù)三十頁\編于十七點目前十頁\總數(shù)三十頁\編于十七點1、設計構建蛋白質突變體模型收集素材——構建原蛋白質模型：掌握和了解蛋白質的一級結構、高級結構、功能域，理化特性、 結構和功能的關系、以及同源蛋白的相關信息。數(shù)據來源：查閱文獻和相關數(shù)據庫。對于已知結構蛋白質，同源建模法或直接構建模型。未知結構的蛋白質，要么先解析其晶體結構，要么根據已知的氨基酸序列進行結構預測。設計突變體——建立突變體模型——借鑒現(xiàn)有的經驗（規(guī)則）改變蛋白質結構：優(yōu)化蛋白的穩(wěn)定性、抗氧化性、對重金屬穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、酶學性質如：Hartley等（1986年）完成有關蛋白質一些重要性質的設計目標及解決辦法表具有一定的參考價值。（Next）考慮不同氨基酸對蛋白質二級結構的影響（第七講結構預測）Chou和Fasman對29種蛋白一級結構和二級結構之間的關系進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)：a—螺旋最強生成者：Glu、Met、Ala、Leu；最強破壞者：Gly、Pro；β-折疊最強生成者：Gly、Ala、Ser；β-轉角最強生成者：Gly、Pro、Asp、Ser；最強破壞者：Ile、Val、Leu。目前十一頁\總數(shù)三十頁\編于十七點蛋白質重要性質設計目標及解決辦法 設計目標 解決辦法Hartleyetal.（1986）思考：為什么能改善蛋白性質目前十二頁\總數(shù)三十頁\編于十七點2、建立和優(yōu)化突變體模型（能量優(yōu)化以及蛋白質動力學分析）利用能量優(yōu)化以及蛋白質動力學分析的方法——預測修飾后的蛋白質的結構將預測結構與原始蛋白質的結構比較利用蛋白質結構—功能或結構—穩(wěn)定性相關知識預測新蛋白可能具有的性質和功能目前十三頁\總數(shù)三十頁\編于十七點3、獲得蛋白質突變體蛋白質分子設計僅停留在理論層面上，沒有試驗證據，這種設計是沒有任何意義的。根據設計，合成蛋白質，或改造蛋白質突變體的基因序列，表達突變體蛋白，然后分離、純化得到所要求的蛋白質。獲得突變體的方法和手段（詳見：蛋白質純化與克隆修飾）分子生物學方法：獲得基因、定點突變、導入宿主細胞、表達基因的產物—蛋白質分離純化：采用分離純化的方法—分離突變蛋白質—測試→目前十四頁\總數(shù)三十頁\編于十七點4、結構和功能分析——蛋白質分子設計的流程對純化的蛋白質突變體進行結構和功能的分析和測試，與原蛋白質比較，是否達到預期改造的目的。若得到的蛋白質突變體沒有實現(xiàn)預期的功能，則需要重新設計和改造；若達到預期，則獲得一種具有特定功能的新蛋白。蛋白質分子設計是一門試驗性科學，是理論設計過程與實驗過程相結合的產物。理論設計與實驗過程兩部分相輔相成，才構成了蛋白質分子設計的全過程。再深入理解：（符合認識論的過程——實踐—認識—再實踐—再認識的過程）學習與知識（知—識）的應用過程（掌握規(guī)律、利用規(guī)律、改造自然、做自然的主人）遇到問題、思考問題、采取對策、解決問題的過程做一個實驗：設計—實驗—再設計—再實驗任何事情：僅僅停留在理論層面上是毫無意義的!認識具有能動性意識對物質具有反作用只要精神不滑坡，辦法總比問題多體會——深刻理解：試驗性科學=理論設計+實驗驗證目前十五頁\總數(shù)三十頁\編于十七點（一）獲得原蛋白質的結構與功能信息 一級和高級結構、功能結構域、同源蛋白、基因、理化性質

（二）建立原蛋白分子的結構模型（原蛋白結構模型）模型來源：PDB或文獻實驗測試三維結構—衍射、NMR……預測：如：同源蛋白進行三維結構預測

（三）結構模型信息分析結構特點——模體——結構域功能活性區(qū)域及分布影響因素二硫鍵數(shù)目和位置（四）選擇設計目標（依據和實踐經驗） （確定突變位點或序列，功能區(qū)二硫鍵數(shù)目和位置）五、設計思路（9個步驟）目前十六頁\總數(shù)三十頁\編于十七點（五）突變體（序列）設計設計的原則 1.充分考慮氨基酸的極性，以利于形成特定的空間結構

α-螺旋（LeuGlu），β-折疊（ValIle），β-轉角（ProGlyAsn) 2.充分考慮氨基酸的排列順序，以利于形成次級鍵構成空間結構設計的基本方法（下周詳細講述）序列最簡化法：少數(shù)幾個氨基酸設計的序列，往往具有一定的對稱性和周期性，從而減少設計的復雜性，并能檢測到一些蛋白質折疊的規(guī)律和方式。模板組裝合成法：將各種二級結構片段通過共價鍵連接到一個剛性的模板分子上，形成一定的三級結構。繞過了蛋白質三級結構中的氨基酸殘基來研究蛋白質中長程作用力，是研究蛋白質折疊和進行蛋白質全新設計規(guī)律摸索的有效手段。目前十七頁\總數(shù)三十頁\編于十七點（六）構建和預測突變體模型→初步檢驗→修正設計結構模型二級結構預測方法：依據信息論和概率統(tǒng)計（ChouFasman法；Garnier方法；Cohen方法）三級結構預測方法和構象搜索方法：依據基團之間相互作用的能量最低原理研究者具備的素質：硬件（計算機軟件、高質量立場）；軟件（結構化學、物化和背景知識）；專業(yè)知識（七）獲得新設計的蛋白質（合成新設計的蛋白質）多肽化學合成法（固相合成技術）獲得新蛋白質基因工程手段：PCR等基因操作-構建突變體-表達-分離純化-新蛋白質。（八）新蛋白質的檢驗是否有多聚態(tài)？是否與設計吻合？是否有三級結構？功能活性？（九）完成新蛋白質的設計反復設計—反復修改——反復試驗→達到預期目標紙上談兵成本低廉目前十八頁\總數(shù)三十頁\編于十七點本節(jié)小結1、蛋白質分子設計：通過蛋白質模型和結構預測來構建具有新功能的蛋白質2、分子設計分類：根據對蛋白質改造的程度、根據改造對象分為兩類不同，蛋白質分子設計分為三類3、掌握蛋白質分子設計的程序 建?！鷥?yōu)化→獲得突變體→結構和功能分析4、掌握蛋白質設計思路（試驗性科學=理論設計+實驗過程）獲得蛋白質結構與功能信息建立分子設計的結構模型結構模型信息分析選擇設計目標突變序列設計預測結果→初步檢驗正確度→修正設計結構模型獲得新蛋白質（合成新設計的蛋白質）新蛋白質的檢驗新一輪蛋白質的設計目前十九頁\總數(shù)三十頁\編于十七點第二節(jié)部分氨基酸的突變部分氨基酸的突變——又稱“小改”，是基于對已知蛋白質的局部改造。是目前蛋白質工程中使用最廣泛的方法。思路：設計目標分子→基因序列或cDNA序列→定點突變→載體系統(tǒng)→宿主細胞表達→特定改變的蛋白質分子→突變體與野生型蛋白性質比較目的：改變蛋白質的性質和提高蛋白質活性蛋白質的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、增加活性、減少副作用、提高專一性闡明蛋白質的結構和功能的關系關鍵的問題：如何恰當?shù)剡x擇要突變的位點（aa殘基）。解決問題的手段：通過蛋白分子設計——分析蛋白質中殘基的性質，借助于已有的蛋白質三維結構或分子模型分析。（詳見以下五方面闡述）目前二十頁\總數(shù)三十頁\編于十七點部分氨基酸改造——從以下五方面選擇“突變”位點 ——針對不同的情況和目的，采取5種不同的改造方法根據結構信息確定突變的位點（堿基）隨機突變缺失突變和接頭分區(qū)突變根據蛋白質的同源性確定功能殘基選擇翻譯后修飾位點突變目前二十一頁\總數(shù)三十頁\編于十七點一、根據結構信息確定突變位點已知高級結構的蛋白：（X射線晶體或NMR譜高分辨率）根據氨基酸殘基在蛋白質結構上的位置來推測其功能。如果已知蛋白質及其配基復合體的結構（包括受體、底物、輔酶和抑制劑），——掌握了活性部分，對這些aa改造，這種方法則更有效。Why？與配基相互作用（形成氫鍵、離子鍵或疏水作用）的aa殘基，根據其與配基基團的距離和取向而確定——突變哪個aa。用定點突變的方式替換這些殘基，驗證這些殘基是否參與結合。這種方法是理解和證明——酶專一性和催化活性——基礎。目前二十二頁\總數(shù)三十頁\編于十七點二、隨機突變什么是？物理和化學誘變劑（射線照射、化學試劑）—突變株—如：E.coli定向進化技術？——體外隨機突變技術優(yōu)勢：能非常容易地產生大量突變體。分析原則：—突變分析真正有功能的保守的氨基酸不能忍受各種類型的突變。如果突變，僅蛋白分子發(fā)生了結構的改變，沒有破壞蛋白質的功能，則該突變位點的殘基對結構和功能的維系可能不是很重要的。突變分析的目的：對突變蛋白分子進行分析，確定突變位點和功能的關系突變體制備缺乏控制，制備和分析大量突變體，才能獲得可解釋的數(shù)據如：不同位置上的氨基酸殘基的幾種不同的替換，究竟哪一個是特異性的替換——特異性地影響蛋白功能獲得新的優(yōu)良性質的蛋白質——掌握新蛋白結構和功能的關系缺點：需要獲得大量的分析突變體，才能解釋究竟哪一個突變是特異性。目前二十三頁\總數(shù)三十頁\編于十七點三、缺失突變分析和接頭分區(qū)突變用能識別序列中多個位點的限制性內切酶消化基因，并分離各個片段。為了產生分散的缺失，在重新連接之前用外切核酸酶消化線性DNA。為了產生分散的插入，可以將合成DNA的小片段（接頭）連接到切割位點上。通過重疊PCR方法，分別導入基因中缺失突變？基因中缺失1個或幾個堿基造成的突變。接頭分區(qū)突變？在整個基因各個位置上插入小量的核苷酸，觀察蛋白質功能。用途：快速確定——基因編碼序列長度；功能上重要的結構域。操作方法：利用經典的重組DNA技術，在體外很容易地構建。操作原理：轉座子誘變也是其中的一種方式目前二十四頁\總數(shù)三十頁\編于十七點舉例：基因調節(jié)區(qū)DNA序列重要元件的定位。如：HIV逆轉錄酶p66亞基（包括兩個更小的亞基p51和p15），兩個小亞基有什么作用呢？用接頭插入突變分析。聚合酶功能位于N端，編碼p51亞基，RNaseH功能則位于C端，編碼pl5亞基。鑒定鼠和人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)關鍵的活性區(qū)域。突變目的：了解基因的長度和不同區(qū)域的功能和作用快速掃描編碼序列的長度并鑒定功能上重要的結構域，進一步以單一氨基酸替換的方法進行更精細的分析。目前二十五頁\總數(shù)三十頁\編于十七點四、利用蛋白質的同源性確定功能殘基？：通過序列同源性比對分析，確定突變位點的方法。我們知道 每個殘基的功能信息，能夠通過比對分析不同種屬的同源蛋白質的序列獲得。兩種假設——（用于定點突變技術分析蛋白質）同源蛋白結構域中：保守的殘基和非保守的殘基。保守殘基可能參與相同功能，或者在維持相同結構中發(fā)揮關鍵作用。在同源蛋白質中差異很大的殘基可能不重要，或者在蛋白質分子識別方面發(fā)揮重要作用。設計實驗驗證（假設）目前二十六頁\總數(shù)三十頁\編于十七點1、保守殘基的突變——蛋白激酶家族基因分析，2個Asp完全保守，Brenner推測有重要作用，見下圖。酵母菌突變驗證，Ala替換Asp。替換Asp210，kcat下降300倍，而與底物結合的Km值則不受影響。 推測Asp210在催化中發(fā)揮基本作用的殘基。替換Asp228，活性完全喪失。突變了118個殘基，只有替換Asp228，活性的完全喪失，證明了個殘基的重要性。哺乳動物cAMP儂賴的蛋白激酶晶體結構的證據，與Brenner的推測一致。保守殘基的研究對理解關鍵氨基酸殘基與蛋白活性關系具有重要的意義Asp210Asp228p126目前二十七頁\總數(shù)三十頁\編于十七點2、非保守殘基的突變在蛋白質家族中，非保守的殘基與家族成員（包括種屬間的變種）的特異性有關，如：病毒的毒力。用定點突變方式進行替換——獲得很多生物學活性的信息， 也可以獲得具有新特異性的突變體蛋白質。舉例：脊髓灰質炎病毒（2種型）：非毒型（I）和毒型（II）Ⅱ型誘發(fā)小鼠脊髓灰質炎，I型對小鼠無毒性。Ⅱ型毒力喪失的突變體證明：90-105殘基負責Ⅱ型病毒對小鼠的毒力若將Ⅱ型的95-104殘基環(huán)區(qū)域轉移到無毒力的I型毒株中，雜合I型毒株表現(xiàn)出對小鼠的毒力，表明：脊髓灰質炎病毒識