彗星電泳方法整理

Cometassay簡介單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(Singlecellgelelectrophoresis,SCGB,又稱彗星試驗(yàn)(Cometassay),是在核酸沉淀法(Nucleoidsedimentation)和暈圈分析(Holoassay)等檢測技術(shù)基礎(chǔ)上逐步發(fā)展起來的一種在單細(xì)胞水平檢測有核細(xì)胞DNA斷裂的新技術(shù)。它主要包括Olive等建立的測定DNA雙鏈斷裂的中性單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)和Singh等建立的測定DNA單鏈斷裂的堿性單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)。此技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于放射生物學(xué)、DNA斷裂與修復(fù)、毒理學(xué)、腫瘤治療評價(jià)、細(xì)胞凋亡等領(lǐng)域的研究。是堿性單細(xì)胞凝膠電泳可以檢測DNA鏈的斷裂和堿不穩(wěn)定點(diǎn)，請問堿不穩(wěn)定點(diǎn)是不是DNA上的脫嘌吟/嘧啶位點(diǎn)呀？還有個(gè)問題就是彗星試驗(yàn)檢測到的DNA斷裂其實(shí)是DNA損傷與修復(fù)的共同作用的結(jié)果，而且DNA修復(fù)的一個(gè)重要方式就是核苷酸切除修復(fù)，因此DNA修復(fù)過程也會造成DNA鏈的斷裂，所以彗星試驗(yàn)所反映的時(shí)間一效應(yīng)關(guān)系，可能并非與真實(shí)的DNA損傷有偏差，因?yàn)樗鼰o法鑒別修復(fù)過程中的DNA斷裂。SCGE技術(shù)的原理：細(xì)胞核中的DNA為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)，而且很致密，通常DNA雙鏈以組蛋白為核心，盤旋而形成核小體。一般情況下，偶然的DNA單鏈斷裂對核酸分子雙股結(jié)構(gòu)的連續(xù)性影響不大，而且不易釋放出來，但是，如果用去污劑破壞細(xì)胞膜和核膜，用高濃度鹽提取組蛋白，DNA殘留而形成類核。如果類核中的DNA有斷裂，斷裂點(diǎn)將引起DNA致密的超螺旋結(jié)構(gòu)松散，在類核外形成一個(gè)DNA暈圈。將類核置于電場中電泳，DNA斷片可從類核部位向陽極遷移，經(jīng)熒光染色后，在陽極方向可見形似彗星的特征性圖像，故稱“彗星試驗(yàn)〃。彗星尾部即為遷移出類核的DNA片段。此時(shí)彗星尾部有可能還與頭部以單鏈或雙鏈的形式相連。DNA損傷越嚴(yán)重，導(dǎo)致DNA超螺旋結(jié)構(gòu)越松散，產(chǎn)生的斷裂點(diǎn)越多，DNA片段越小，從而在彗星尾部出現(xiàn)的DNA斷片越多，則慧尾的長度、面積和熒光強(qiáng)度越大。通過測量彗星尾部的長度、面積或熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，可以對DNA的損傷程度進(jìn)行定量分析。隨著SCGE技術(shù)的發(fā)展，可測量的指標(biāo)也越來越多，而且更準(zhǔn)確。目前，用于SCGE分析的指標(biāo)主要分為四類，包括形狀指標(biāo)、距離指標(biāo)、強(qiáng)度指標(biāo)和矩類指標(biāo)。其中形狀指標(biāo)有彗星細(xì)胞率；距離指標(biāo)包括彗星尾長、彗星全長、彗星頭部半徑、尾部半徑；強(qiáng)度指標(biāo)包括頭部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、頭部面積、尾部面積等；矩類指標(biāo)包括尾矩、Olive尾矩等。依靠目鏡測微尺人工測量彗星距離指標(biāo)，主觀性較強(qiáng)，人為誤差較大，而且矩類指標(biāo)更需要人工通過公式計(jì)算得出，使研究人員的工作量加大。因此，研究人員渴望開發(fā)出一種專用的彗星圖像分析軟件。近年來，各國研究機(jī)構(gòu)紛紛推出各自的圖像分析軟件，這些分析軟件可以快速提供一系列評價(jià)參數(shù)，如彗星總長、尾長、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等，更好地客觀定量DNA損傷。目前，用于彗星分析的軟件包括英國KineticImaging公司的Komet5.5、PerceptiveInstruments公司的CometAssayIII、LAI公司的LACAAS、美國NIH的ImagJ、TriTek公司的CometScoreTM、印度原子能研究所的SCGE-Pro、奧地利癌癥研究所開發(fā)的自動分析軟件等。其中的部分軟件可以到其相應(yīng)網(wǎng)站下載，但最好與相應(yīng)的彗星分析系統(tǒng)硬件設(shè)備配套使用，價(jià)格昂貴，提高了研究成本。新近研發(fā)的彗星分析軟件(CometAssaySoftwareProject,CASP)很好地解決了這一問題，該軟件可以在普通微機(jī)上運(yùn)行，界面友好，使用方便，分析速度快，可以一次同時(shí)給出最多達(dá)13個(gè)指標(biāo)，分析結(jié)果避免了人為誤差，更加客觀和準(zhǔn)確，結(jié)果可以以.txt文件直接輸出，SPSS等統(tǒng)計(jì)軟件可以直接讀取其輸出結(jié)果，便于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，節(jié)省大量人力物力。中性電泳與堿性電泳在適合的實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，沒有損傷的細(xì)胞在中性或堿性條件都不可能做出尾巴。中性檢測DNA雙鏈斷裂，堿性檢測DNA單鏈斷裂。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，可以選擇不同的實(shí)驗(yàn)條件，也可以同時(shí)選擇兩種條件，結(jié)果進(jìn)行對比。拿電離輻射來說，中性和堿性檢測的敏感范圍不同，堿性SCGE的敏感范圍值偏低，如可以小到0.05Gy，而中性SCGE的敏感范圍值偏高，它可能檢測不到0.05Gy的DNA損傷，但可以檢測大到100Gy的損傷，而相對中性SCGE來說，堿性SCGE在大劑量照射時(shí)的各項(xiàng)指標(biāo)容易形成平臺。從修復(fù)方面來說，雙鏈斷裂的修復(fù)較單鏈斷裂的修復(fù)慢，損傷重，后果更嚴(yán)重，雙鏈斷裂是后來形成染色體畸變和微核的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。從文獻(xiàn)上來看，藥物引起的DNA損傷多采用堿性SCGE檢測單鏈斷裂，A：堿性電泳是在1988年建立的，而最開始彗星方法都是在中性條件下做的（1984），所以我認(rèn)為，這是方法逐步改進(jìn)的過程。堿性條件下，DNA解旋，檢測出來的應(yīng)該是雙鏈和單鏈斷裂的綜合損傷，這樣可以提高試驗(yàn)的靈敏度，也就是您說的可以檢測到0.056尸,而中性電泳做不到這一點(diǎn)。B：中性條件跑出來的是DNA的雙鏈，單鏈斷裂不會出來，而強(qiáng)堿性條件下，破壞了斷裂部位連接堿基的氫鍵，這樣，雙鏈斷裂也就成了單鏈形式，可以說堿性檢測的是“雙鏈和單鏈斷裂的綜合損傷”，兩種電泳條件的最大區(qū)別是適用于不同的實(shí)驗(yàn)需求。堿性條件的SCGE的建立也是為了滿足不同實(shí)驗(yàn)需要。實(shí)踐中要根據(jù)DNA致傷因素詵擇實(shí)驗(yàn)條件，如：電離輻射對DNA的損傷以雙鏈斷裂為主，應(yīng)該選擇中性SCGE，而且可以排除環(huán)境因素對DNA損傷的影響（因?yàn)镈NA很容易受到環(huán)境因素的影響而斷裂一一單鏈為主），如果用堿性的話，就不能區(qū)分哪些是實(shí)驗(yàn)因素引起的斷裂，哪些是其它影響因素引起的斷裂。如果實(shí)驗(yàn)致傷因素是以DNA單鏈為主，那就應(yīng)該選擇堿性SCGE了。有一點(diǎn)需要說明一下，堿性SCGE確實(shí)增加了檢測的敏感性（中性SCGE達(dá)不到），但犧牲了特異性，DNA很容易受許多因素的影響而產(chǎn)生斷裂，如吸煙、飲酒等不良生活習(xí)慣、環(huán)境污染等因素。所以堿性條件很難從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中剔除哪些是非實(shí)驗(yàn)致傷因素造成的，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果會或多或少有點(diǎn)影響。所以說SCGE條件的選擇主要還要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要來定。中/堿性單細(xì)胞凝膠電泳UnwindingoftheDNAandelectrophoresisatneutralpH(7-8)predominantlyfacilitatesthedetectionofdoublestrandbreaksandcrosslinks;unwindingandelectrophoresisatpH12.1-12.4facilitatesthedetectionofsingleanddoublestrandbreaks,incompleteexcisionrepairsitesandcrosslinks;whileunwindingandelectrophoresisatapHgreaterthan12.6expressesalkalilabilesites(ALS)inadditiontoalltypesoflesionslistedabove(Miyamaeetal.,1997).Lysisandelectrophoresiscanbeperformedinalkaline(optionA)orneutral(optionB)conditions.UseoptionAtodetectthecombinationofDNAsingle-strandbreaks,double-strandbreaksandalkali-labilesitesintheDNA,andoptionBtodetectonlyDNAdouble-strandbreaks.一.玻片處理將玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20分鐘。用熱水將肥皂等污物洗去，再用自來水反復(fù)沖洗，最后再用蒸餾水沖洗3?5次。必要時(shí)再置95%乙醇中浸泡1小時(shí)，然后擦干或烘干備用。新玻片常有游離堿質(zhì)，因此應(yīng)用清潔液或10%鹽酸浸泡24小時(shí)，然后分別用自來水及蒸餾水徹底洗滌。用無水乙醇提前浸泡磨砂載玻片和蓋玻片，至少過夜(用前最好預(yù)熱下)，再使用，可減少脫膠的問題。Labelslideonfrostedendusingapencil,notapen.二至四步均應(yīng)在暗處進(jìn)行，以避免額外的DNA損傷performedunderdimyellowlightstopreventDNAdamagethepremiseisthatusuallightingwillcauseDNA

damagebuthavenodatatosupportthisconcern.先準(zhǔn)備裂解液，加應(yīng)用液組分溶解至清澈后放冰箱！二?膠的配制與鋪設(shè)鋪膠后都要加蓋片(可不加)，目的是使膠平整，凝膠固化后移去蓋片，再鋪另一層，普通波片表面比較光滑，容易脫膠，文獻(xiàn)多用毛玻璃片，應(yīng)該好一點(diǎn)，但也不能完全避免脫膠。表l.Samplepreparationbuffei(forplanttissueslicedwithafreshrazorblade)pH7.4終濃度組分100mL200mL160mMNaCl0.9g1.8g8mM(25X)Na2HPO4A：4mLA：8mL4mM(50X)NaH2PO4B：2mLB：4mL50mMNa2EbTA.2H2O1.9g3.8g配膠用PBS(0.1MpH7.4)用PBS母液配制表2.制片用膠10mL100mL保存NMPA(0.75%)' 0.75g干燥，除濕LMPA(0.75%)0.075gLMPA75uL+樣品25uL，終濃度0.5%LMPA50uL+樣品50uL，終濃度0.5%4C保存，37-42C操作LMPA(0.5%)0.05g4C保存，37-42C操作第一層：0.75%正常熔點(diǎn)膠，100』，置于室溫＞5min使其固化在燒杯里配100ml左右的正常熔點(diǎn)瓊脂糖，煮沸之后把玻片放進(jìn)去，讓膠液浸過1/3之后，撈出玻片，用布或者別的什么把一面擦干，然后把玻片水平放置，晾干。*Theslidesmaybeairdriedorwarmedforquickerdrying.Storetheslidesatroomtemperatureuntilneeded;avoidhighhumidity(濕)conditions.Wegenerallyprepareslidesthedaybeforeuse.*M.Klaude,S.Eriksson,J.Nygren,andG.Ahnstrom(1996)Thecometassay:mechanismsandtechnicalconsiderations.MutationRes.363:89-96.第二層：0.75%低熔點(diǎn)膠，75pl+25』樣品懸液，置于4°C固化1min(也可以把第二層膠配成1%，然后把細(xì)胞和膠按照1：1的比例配，這樣細(xì)胞多了，終濃度也是0.5%)附：三層膠法：Gentlyslideoffcoverslipandaddathirdagaroselayer(75以LLMPA)totheslide.Replacecoverslipandreturntotheslidetrayuntiltheagaroselayerhardens(~3to5minutes).Removecoverslip.凝膠不要提前配置，可以提前稱量好，分裝，用前加PBS至5ml，反復(fù)用，效果不好，不易鋪平，鋪膠前低熔點(diǎn)膠PBS溶解、煮沸，要溫于37度水浴箱，再和細(xì)胞混合(低熔點(diǎn)瓊脂糖在恒溫放久了，鋪膠染色后會容易造成背景很臟)，不會破壞細(xì)胞。關(guān)于脫膠問題，有幾點(diǎn)需要注意：0.Ifthegelsarenotstickingtotheslidesproperly,avoidinghumidityand/orincreasingtheconcentrationofNMAagaroseinthelowerlayerto1.5%shouldeliminatetheproblem.第一層凝膠在經(jīng)過裂解、解旋及電泳步驟后早就已經(jīng)恢復(fù)了凝膠狀態(tài)，與光滑玻片的粘合肯定不如以前緊密，因此在電泳及中和后更要輕夾輕放，玻片最好水平地取出，千萬不能晃蕩，要不然水的力量很容易把凝膠拖歪甚至全部扯下。中和液不要太多，能浸過玻片就可以了，液體太多浮力就大，凝膠容易漂起來。Q中和的時(shí)間不能過長，一般5分鐘就可以了，時(shí)間長了也容易掉膠。雙中和的次數(shù)：只宜一次。一般文獻(xiàn)上寫三次，是因?yàn)殡娪疽褐械膹?qiáng)堿顆粒會附著在磨砂玻片的粗顆粒上，如果不中和干凈的話很容易被EB染色。如果使用普通透明玻片的話就不會有這樣的問題，一般染色后的背景都很均勻干凈。麻三.裂解Placeslidesbacktobackverticallyina50mLcoplinjarcontaining40mLofcoldLysingSolution.Placethecoplinjarsintherefrigeratorforaminimumof1hour.Inourexperience,slidesmaybestoredforatleast4weeksincoldLysingSolutionwithoutaffectingtheresults.表3.中性裂解液 表4.堿性裂解液終濃度組分990mL2.5MNaCl146.1g30mMNa2EDTA-2H2O11.2g10mMTris1.2g溶解完全后調(diào)節(jié)pH至8,儲備液室溫保存應(yīng)用液：99毫升，使用前加1%TritonX-100（1ml）終濃度組分990mL2.5MNaCl146.1g100mMNa?EDTA-2H2O37.2g10mMTris1.2g加8克NaOH，溶解后調(diào)pH10，應(yīng)用液：99毫升，使用前加1%TritonX-100（1ml）將微電泳槽置于新鮮配制的裂解液中，4°C冰箱中裂解1.5-2h（時(shí)間可變），裂解時(shí)間短可能導(dǎo)致彗星頭尾沒有分離。如果裂解不徹底，最后電泳的時(shí)候DNA還被核膜包裹著，斷裂的片斷就分不開了，而且裂解液的配方也非常重要。在配置裂解液的時(shí)候一定要藥品充分溶解，從冰箱里拿出裂解液的時(shí)候，也許會有一些結(jié)晶的東西，一定要加熱到透明才可以。LysingSolutiin解液配方（使用前在4°C預(yù)冷）：中性：2.5MNaCl146.1g30mMNa2EDTA.2H2O11.2g10mMTris1.2gPH=7-8.0（pH值要調(diào)得比較準(zhǔn)確才行）1%N-SodiumLauroylSarcosinate（肌氨酸鈉*可不加），用去離子水定容至890ml（植物組織不用加10%10mlDMSO，定容到990ml）。過濾除菌，為貯備液，室溫保存。應(yīng)用液：89毫升，用前加1%TritonX-100（1ml）,10%10mlDMSO*OlivePL,BanathJP.DetectionofDNAdouble-strandbreaksthroughthecellcycleafterexposuretoX-rays,bleomycin,etoposideand125IdUrdIntJRadiatBiol.1993Oct;64（4）:349-58.中的配方:30mMNa2EDTA.2H2O0.5%SDS,pH8.0堿性：2.5MNaCl146.1g100mMNa2EDTA.2H2O37.2g10mMTris1.2g加700ml水，用約8克NaOH,大約20分鐘后溶解完全，調(diào)節(jié)pH至10。用去離子水定容至890ml(植物組織不用加10%10mlDMSO，定容到990ml)。過濾除菌，為貯備液，室溫保存。應(yīng)用液：89毫升，用前加1%TritonX-100(1ml),10%10mlDMSO(消除血液或動物組織中血紅蛋白釋放的鐵產(chǎn)生的自由基)，使用前置冰箱至少30min。ThepurposeoftheDMSOinthelysingsolutionistoscavengeradicalsgeneratedbytheironreleasedfromhemoglobinwhenbloodoranimaltissuesareused.Itisnotneededforothersituationsorwheretheslideswillbekeptinlysingforabrieftimeonly.Sodiumlaurylsarcosinate,whichweusedearlier,isnotincludedinthisversion,butmaybeneededforsomecelltypes.肌氨酸鈉破壞細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，有部分文獻(xiàn)報(bào)道中沒提到裂解液中加SLS的，加的話有助于對細(xì)胞膜的破壞，只是配裂解液時(shí)不好溶。第四屆彗星分析研討會討論了SCGE的方法問題，【the4thInternationalCometAssayWorkshop(Ulm,Germany,22-25July2001)】專家組認(rèn)為加肌氨酸鈉是多余的。(Theadditionof1%N-lauroylsarcosineisnowconsideredredundant.)裂解液時(shí)間長了會結(jié)晶，(濃度太高了)，是不宜久存的，每次做的時(shí)候都要最先配制，而且用加熱磁力攪拌器不停攪拌，同時(shí)就可以干別的，完全溶解后再放入冰箱預(yù)冷。裂解液中，最難溶解的是SLS，它在中性的時(shí)候不易溶于水，所以你把其他的藥品加進(jìn)去后，先不要加SLS，這里需要磁力攪拌器攪拌，但是時(shí)間不會很長。溶解后，用NaoH把PH調(diào)到10，這里調(diào)PH值要用NaoH固體，然后把SLS加進(jìn)去，在用磁力攪拌器攪拌，一般需要加熱，50度左右就可以了。大約攪拌1個(gè)小時(shí)就可以溶解。這時(shí)，溶液應(yīng)該是透明的，不是乳白色的。加熱溶解的過程中，可能會損失一定的水分，等攪拌完了后，要把溶液的量補(bǔ)充到你最后需要的體積。從冰箱中取出裂解液后，裂解液如果有沉淀，就把它放在37度水浴中讓它充分溶解，然后把DMSO和TritonX-100加進(jìn)去，這時(shí)，還是乳白色的，放在37度中放一會就可以了。注意，溶液的顏色是透明清亮的，渾濁的話，不能起到裂解的效果，最后跑不出彗星來。

四.解旋與電泳取出載玻片，用雙蒸水漂洗去掉多余的去垢劑和鹽分（2-3x5min），置于提前加入1XTBE電泳液的水平電泳儀中4°C解旋15min（10-30min）,使原來致密的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)充分松解；20V,200mA電泳20分鐘，通過調(diào)節(jié)液面來調(diào)電壓。電泳電壓是根據(jù)電泳槽兩極間的距離與電場強(qiáng)度（0.8-1.0V/cm）的乘積設(shè)定的。Differentgelboxeswillrequiredifferentvoltagesettingstocorrectforthedistancebetweentheanodeandthecathode.電壓先調(diào)到最大，電流200mA,然后通過液面來調(diào)節(jié)電壓Turnonpowersupplyto25volts(~0.74V/cm)andadjustthecurrentto300milliamperesbyraisingorloweringthebufferlevel.Dependingonthepurposeofthestudyandontheextentofmigrationincontrolsamples,electrophoresetheslidesfor10to40minutes.終濃度組分1L900mMTris終濃度組分1L900mMTris109g900mMH2BO355.6g20mMNa2EDTA.2H2O7.4g用時(shí)稀釋成1X -ElectrophoresisBuffer電泳液配方（使用前在4°C預(yù)冷）:表5.中性解旋與電泳液（10X）pH8.5終濃度組分200mL500mL10NNaOH—200g200mMNa2EDTA14.89g應(yīng)用液：30mLNaOH+5mLEDTA定容至1L室溫保存，兩星期內(nèi)用完！表6.堿性解旋與電泳液（10X）>pH13五.中和堿切斷電源，取出玻片，把玻片放在一個(gè)裝有雙蒸水的盒子里浸一下，洗掉多余的電泳液，然后把玻片撈起來豎放到吸水紙上吸干多余的水分，置染缸，中和緩沖液浸洗，3X5min（建議1X5min，防脫膠）。中和是為染色做準(zhǔn)備的，中和后容易著色。NeutralizationBuffer中和緩沖液配方（使用前在4°C預(yù)冷）storedforuptooneyear：表7.中和液（堿性電泳用）pH7.5終濃度組分1L0.4MTris48.5g加水800ml，HCl調(diào)pH至7.5定容至1000ml，室溫可放置1年用時(shí)稀釋成1X有人中和后還要用76%和96%的乙醇處理，這一步的作用是脫水固定，固定后膠放置一段時(shí)間后也可以看，最好電泳后立即看的片子，以免影響圖像質(zhì)量。但是如果需要脫水的話就只能選擇透明底的玻片，因?yàn)槟ッＦ砻娌黄?，在酒精脫水后凝膠干燥形成顆粒，會被EB染色而嚴(yán)重影響讀片質(zhì)量。Drainslides,exposethem（e.g.,5min）tocold100%ethanolorcold100%methanol,andallowtodry.Storeindryarea.Ifstoringformorethan2-3d,dipslidesinethanolanddrythem.Driedslidescanbestoredforseveralmonths,butbeforeanalysis,rehydratebyaddingathinlayerofagarosetoreducebackgroundfluorescence,andrestainwithpropidiumiodide.六.染色和觀察Slidescanbestoredinhumidified,lighttightboxesinthecoldroom(at4C).注意要保濕，可以放在平皿里，皿底部鋪紗布，滴點(diǎn)蒸餾水即可，2.5pg/ml漠化乙錠(EB)染色，(染色是不用槍的，用1毫升的一次性注射器，操作比較簡單)，染色后直接把片子放到專用的小染缸中洗滌，去掉多余染液，然后濾紙吸去多余水分，這樣背景會處理的很干凈，在熒光顯微鏡下(激發(fā)波長515-560nm，綠光)觀察。未受損細(xì)胞表現(xiàn)為以圓形熒光核心，即彗星頭部，沒有尾巴。受損細(xì)胞則有彗尾伸向陽極，形成一個(gè)亮的頭部和尾部。一般用20倍或者40倍放大就可以了。40倍效果更好一些，細(xì)胞比較好看。放大40倍的時(shí)候，一個(gè)視野下有4-10個(gè)細(xì)胞就行了。染色后的雜質(zhì)問題主要有兩個(gè)可能：1、標(biāo)本不干凈，來自離心管等；2、染色液過多，結(jié)晶，背景很亮，影響圖像質(zhì)量。染料選擇：SYBRGreenI是結(jié)合雙鏈的內(nèi)嵌染色劑，而堿性電泳是把DNA雙螺旋解開成單鏈的，SYBRGreenI用于檢測雙鏈，DAPI的敏感性比EB要好一點(diǎn)，也可以用，不過也是強(qiáng)致癌物。StainingSolutionEthidiumBromide(10XStock-20pg/mL):add10mgin50mLdH2O,storeatroomtemperature.For1Xstock：mix1mLwith9mLdH2O.SYBR?Green/Gold:Add1pLofprovidedstocksolutionto10mLofTEbuffer(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH7.5)orTBEbuffer(89mMTrisbase,89mMboricacid,1mMEDTA,pH8.0)topreparea1:10,000dilution.Makefreshpriortouse.Stainingsolutionisstableforseveralhoursatroomtemperatureandfor1-2dayswhenrefrigerated.表8.TBEbufferfordilutionofSYBR^Green/GoldpH8.0終濃度組分100mL89mMTris1.07g89mMH2BO30.55g1mMNa2EDTA.2H2O0.037gPropidiumIodide2.5pg/mLofpropidiumiodideindistilledwaterfor20minYOYO-1StocksolutionofYOYOis1mM(MolecularProbe,Eugene,OR).Workingsolutionhas0.25pMYOYO-1in2.5%DMSOand0.5%sucrose.Take"LofYOYO-1andaddto4mlofdistlledwater.Thenadd200pLoftheDMSOsucrosesolutionmentionedbelow.Workingstainingslutiioncanbedispensedin500pLaliquotesandstoredat-20degreesHoescht33258DAPIAcridineOrangeArabidopsisRibonucleotideReductasesAreCriticalforCellCycleProgression,DNADamageRepair,andPlantDevelopment醐TheCometAssaykitfromTrevigen(Gaithersburg,MD)wasusedwithminormodifications.SeedlingswerechoppedwitharazorinaPetridishkeptoniceandcontaining500Mlof1xPBSplus20mMEDTA.Theresultingmixturewasfilteredthrougha60l」mnylonmesh.40口lofnucleiwasmixedwith400四Lof1%low-melting-pointagarose(prewarmedat37C)andplacedontoTrevigen-precoatedslides.Afterincubatinginlysissolution(2.5MNaCl,100mMEDTA,pH10,10mMTris,1%sodiumlaurylsarcosinate,and1%TritonX-100)for1hat4C,thenucleionslideswereunwoundinalkalinesolution(0.3NNaOHand5mMEDTA)for40minandneutralizedtwotothreetimesin1xTBE(Tris-borate/EDTA)for5min.Theslideswererunat1V/cmfor10minin1xTBEandthendippedin70%ethanolfor5min.Afterair-drying,theslideswerestainedwitha1:10,000dilutionofSYBRgreen.Antifadesolution(1%p-phenylenediaminedihydrochloridein0.XPBSand90%glycerol)wasaddedtoslidesthatwereexaminedbyepifluorescencemicroscopy.ThepercentageofDNAineachcomettail(TDNA%)wasevaluatedwiththeCometScoresoftware()andassignedanumber(0to4),withahighernumbercorrespondingtoahigherTDNA%(Collinsetal.,1997).DNAdamageunitsforeachgenotypewerederivedbyaveragingthedatafromfourslides.Onehundredcometswerescoredperslide.*DNAdamageandrepairinArabidopsisthalianaasmeasuredbythecometassayaftertreatmentwithdifferentclassesofgenotoxinsAbout75-150mgoftheplantmaterialwereharvested,BrieflyrinsedinGM,carefullydriedwithapapertowelandthenimmediatelyusedforthecometassayorfrozeninliquidnitrogenandstoredat80°g.FreezingandstoringdidnotsignificantlyinfluencetheextentofDNAmigration.Thecometassaywasperformedinadarkroomwithdimredlight.Microscopicslideswereprecoatedwithalayerof1*(0.75%)normalmeltingpointagaroseandthoroughlydriedat60°e.Theseedlingswereslicedin300-400MlPBS(160mMNaCl,8mMNa2HPO4,4mMNaH2PO4,pH7.0)containing50mMEDTAonicewithafreshrazorblade.Twodropsof30Woftheresultingsuspensionofnucleiweredroppedseparatelyoneachslide,mixedwiththesamevolumeofliquid1%lowmeltingpointagarose(GibcoBRL,Gaithersburg,USA)at42dandcoveredwitha22mmx22mmcoverglass.Nucleiwerethensubjectedtounwindinginhighsalt(2.5MNaC210mMTris-HCl,pH7.5,100(30)mMEDTA)containing1%EDTATtitonX-100for20min(N/Nprotocol)atroomtemperature.Equilibrationfor3x5minin1xTBE(90mMTris-borate,2mMEDTA,pH8.4)bufferonicewasfollowedbyelectrophoresisatroomtemperatureinthesamebufferfor6min(N/Nprotocol)at31V(1V/cm),15-17mA.*CometassayinhigherplantsTomdGichnerIsolationofnucleifromleavesTheplantcellhasawallthatcannotberemovedastheanimalcellmembranebylysisinhighconcentrationsofdetergentsandsalts,andsothenucleihavetobeisolatedmechanically.Itisexceedinglyimportanttogentlyisolatethenucleifromtheleaves.Alloperationsareconductedunderdimoryellowlight.Asmallpartoftheleaf(about2x1cmareplacedina60mmplasticPetridish.Ontoeachleaf200to300plofcold0.4MTrisbufferisspread.Usingafreshrazorblade,theleafisslicedintoafringe.ThePetridishiskepttiltedintheicesothatthenucleiwouldcollectinthebuffer.0.4MTrisbufferDissolve9.7gTris(SigmaUSA,T-1378)in180mldH2O,setpHto7.5withconcentratedhydrochloricacid,adddH2Oto200ml,storeatroomtemperature.StepofCometAssay低熔點(diǎn)膠在沸水浴中溶化后移至42r水浴鍋（準(zhǔn)備多一倍備用）；鋪好第一層膠的載玻片置于BlockHeater上（每個(gè)樣5片）；打冰三盒，將干凈玻璃培養(yǎng)皿放入預(yù)冷；從