第三十四章抗微生物藥物和敏感性試驗

第三十四章

抗微生物藥物和敏感性試驗

第一頁，共七十四頁。

第一節(jié)臨床常用抗菌藥物

抗菌藥物是指具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學(xué)合成藥物。前者是真菌、放線菌、細菌等的代謝產(chǎn)物，后者是經(jīng)化學(xué)改造的半合成抗生素和化學(xué)合成藥物。第二頁，共七十四頁。一、青霉素類抗生素：包括青霉素G、耐青霉素酶青霉素、廣譜青霉素等。二、頭孢菌素類抗生素：包括第一代、第二代、第三代頭胞菌素。三、其他β－內(nèi)酰胺類抗生素（一）單環(huán)β－內(nèi)酰胺類抗生素，主要有氨曲南和卡蘆莫南。第三頁，共七十四頁。（二）頭霉素類和氧頭孢烯類抗生素，主要有頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢美唑。（三）碳青霉烯類抗生素，主要有亞胺培南、米洛培南、必安培南、帕尼培南。（四）β－內(nèi)酰胺類抑制劑，主要有克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦。第四頁，共七十四頁。四、氨基糖苷類抗生素按其來源分為：①由鏈霉菌屬發(fā)酵濾液提取獲得，有鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龍霉素、新霉素；②由小單胞菌屬發(fā)酵濾液中提取，有慶大霉素、福提霉素；③半合成氨基糖苷類，有阿米卡星、奈替米星、地貝卡星等。第五頁，共七十四頁。五、喹諾酮類抗生素第一代為窄譜抗生素，有新惡酸、奈啶酸和惡喹酸。第二代為廣譜類抗生素，抗菌強度依次為環(huán)丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、氟咯沙星、培氟沙星、諾氟沙星。第三代為超廣譜類抗生素，有司帕沙星、妥舒沙星、左氟沙星等。第六頁，共七十四頁。六、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，常用的有紅霉素、柱晶白霉素、麥迪霉素、乙酰螺旋霉素。七、四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素（一）四環(huán)素為廣譜抗生素，抗菌活性的順序為米諾環(huán)素＞多西環(huán)素＞美他環(huán)素＞地美環(huán)素。第七頁，共七十四頁。（二）氯霉素類抗生素，包括氯霉素、甲砜霉素。（三）林可酰胺類抗生素，主要有鹽酸林可霉素、克林霉素。八、糖肽類抗生素，常用的有萬古霉素和替卡拉寧第八頁，共七十四頁。九、磺胺類藥物及增效劑分三類：①用于全身感染的藥物，分為短效、中效、長效三類，有磺胺甲惡唑，磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪；②腸道起作用的藥物有柳氮磺胺啶銀、磺胺二甲氧嘧啶；③局部應(yīng)用的藥物有磺胺米隆、磺胺醋酰鈉。第九頁，共七十四頁。十、其他合成抗菌藥（一）硝基呋喃類用于腸道、尿路感染和外用消毒，有呋喃坦啶和呋喃唑酮。（二）硝基咪唑類對厭氧菌有抗菌作用，對需氧菌無效，有甲硝唑和替硝唑。第十頁，共七十四頁。第二節(jié)抗菌藥物敏感性試驗

（AST）一、意義①可預(yù)測抗菌治療的效果，“敏感”治療可能有效；“耐藥”肯定失?。虎谥笇?dǎo)醫(yī)生選擇使用抗生素，AST的結(jié)果為“耐藥”，即應(yīng)更換藥物；③提供所選擇藥物的依據(jù)；④監(jiān)測耐藥性，分析耐藥菌變遷，掌握耐藥菌感染病流行病學(xué)，控制和預(yù)防耐藥菌感染發(fā)生和流行。第十一頁，共七十四頁。二、試驗常規(guī)抗菌藥物選擇

在標(biāo)準(zhǔn)中分成A、B、C、U四組,A組所列的抗生素為常規(guī)首選藥敏試驗藥物,B組為臨床使用主要抗生素,尤其在醫(yī)院感染時使用的抗生素，可在下列情況下使用：①對A組同類抗生素耐藥；②標(biāo)本來源不同時，如三代頭孢菌素使用于腦脊液中的腸桿菌，磺胺甲惡唑使用于尿道分離的細菌；③多種微生物感染；④多部位感染；⑤感染流行的控制；⑤對A組抗生素過敏、耐受或無反應(yīng)。第十二頁，共七十四頁。C組藥物用于對A組藥物耐藥的流行菌株或?qū)組藥物過敏的病人和某些不常見的細菌（如腸外分離的沙門菌屬或耐萬古霉素腸球菌）。U組僅用于尿道中分離的細菌，不作為尿道外分離菌的常規(guī)藥敏試驗。第十三頁，共七十四頁。(一）非苛養(yǎng)菌藥敏試驗抗生素的選用

A組一級試驗并常規(guī)報告的抗微生物藥,如葡萄球菌屬用苯唑西林和青霉素。B組一級試驗有選擇報告的抗微生物藥,如腸球菌屬用萬古霉素。C組補充試驗有選擇報告的抗微生物藥，如葡萄球菌屬用氯霉素。U組僅用于泌尿道的補充實驗的抗微生物藥，如葡萄球菌屬用洛美沙星和諾氟沙星。第十四頁，共七十四頁。(二）苛養(yǎng)菌藥敏試驗抗生素的選用A組一級試驗并常規(guī)報告的抗微生物藥,如肺炎鏈球菌用紅霉素和青霉素。B組一級試驗有選擇報告的抗微生物藥,如肺炎鏈球菌用頭孢噻肟或頭孢曲松

。C組補充試驗有選擇報告的抗微生物藥，如肺炎鏈球菌用頭孢呋辛

。第十五頁，共七十四頁。三、稀釋法瓊脂選擇法是將藥物混勻于瓊脂培養(yǎng)基中，配制含不同濃度藥物平板，使用多頭接種器接種細菌，經(jīng)孵育后觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含藥物濃度測得MIC。結(jié)果判斷將平板置于暗色、無反光表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的藥物稀釋度為終點濃度（磺胺可見少許散在細菌生長）。試驗菌的結(jié)果報告可用MIC（μg/ml）或用敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）報告。第十六頁，共七十四頁。四、紙片瓊脂擴散法

（一）試驗原理將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關(guān)關(guān)系。第十七頁，共七十四頁。(二)培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片1．抗菌藥物紙片選擇直徑為6．35mm，吸水量為20μl的專用藥敏紙片用逐片加樣或浸泡方法使每片含藥量達規(guī)定所示。含藥紙片密封貯存2℃－8℃且不超過1周。2．培養(yǎng)基水解酪蛋白（MH）培養(yǎng)基是兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，4℃保存。第十八頁，共七十四頁。（三）細菌接種用0．5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌液濃度，在瓊脂表面均勻涂片,在15min內(nèi)接種完畢。將含藥紙片緊貼于瓊脂表面,35℃孵育18h后閱讀結(jié)果。（四）結(jié)果判斷和報告用精確度為1mm的游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，作出“敏感”,“耐藥”和“中介”的判斷。第十九頁，共七十四頁。五、E試驗

（一）原理E試條是一條5mm×50mm的無孔試劑載體，一面固定有預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗生素，另一面有讀數(shù)和判別的刻度。將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗生素抑制細菌的特定濃度，又稱抑制濃度（IC），它與MIC呈高度相關(guān)。第二十頁，共七十四頁。（二）細菌接種和加樣使用厚度為4mmMH瓊脂平板，用0．5麥?zhǔn)蠞舛鹊膶?shù)期菌液涂布，待瓊脂平板完全干燥，用E試驗加樣器將試條放在已接種細菌的平板表面，試條全長應(yīng)與瓊脂平板緊密接觸，試條MIC刻度面朝上濃度最大處靠平板邊緣。第二十一頁，共七十四頁。

（三）結(jié)果判斷和報告讀取橢圓環(huán)與E試驗試條的交界點IC值。與NCCLS的稀釋法MIC參考值高度相關(guān)。第二十二頁，共七十四頁。六、藥物敏感試驗結(jié)果解釋

“敏感”即表示測試菌可被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達到的血藥濃度所抑制；“耐藥”即表示測試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所抑制，臨床治療無效?！爸薪椤闭咛崾驹摷毦鷮ΤＲ?guī)用藥體液或組織中的藥物濃度的反應(yīng)率低于敏感株，使用高于正常給藥量有療效。第二十三頁，共七十四頁。七、聯(lián)合藥物敏感試驗和殺菌試驗

（一）意義目的在于：①治療混合性感染；②預(yù)防或推遲細菌抗生素耐藥性的發(fā)生；③聯(lián)合用藥可以減少劑量以避免達到毒性劑量；④聯(lián)合用藥比單一用藥時效果更好。第二十四頁，共七十四頁。出現(xiàn)4種結(jié)果：①無關(guān)作用小，兩種藥物聯(lián)合作用的活性等于其單獨活性；②桔抗作用，兩種藥物聯(lián)合作用顯著低于單獨抗菌活性；③累加作用，兩種藥物聯(lián)合作用時的活性等于兩種單獨抗菌活性之和；④協(xié)同作用，兩種藥物聯(lián)合作用顯著大于其單獨作用的總和。第二十五頁，共七十四頁。

協(xié)同作用發(fā)生原理①聯(lián)合用藥的抗菌藥物在不同部位抑制細菌細胞壁合成或封閉細菌的新陳代謝；②β－內(nèi)酰胺類抗生素增加了氨基糖苷類藥物進入細菌細胞；③聯(lián)合用藥的抗菌物之一是抑制β－內(nèi)酰胺酶活性的藥物。聯(lián)合用藥時，必須做聯(lián)合抗菌藥物敏感性試驗。第二十六頁，共七十四頁。（二）聯(lián)合抑菌試驗

棋盤稀釋法是常用的定量方法，首先分別測定擬聯(lián)合的抗菌藥物對檢測菌的MIC。藥物最高濃度為MIC的2倍，對倍稀釋。兩種藥物的稀釋分別在方陣的縱列和橫列進行，這樣在每管（孔）中可得到不同濃度組合的兩種藥物混合液。接種菌量為5×105CUF／ml，35℃孵育18h后觀察結(jié)果。計算部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)。第二十七頁，共七十四頁。FIC指數(shù)0．5為協(xié)同作用；0．5－1為相加作用；1～2為無關(guān)作用；＞2為拮抗作用。第二十八頁，共七十四頁。（三）最低殺菌濃度測定MBC是指能殺滅99．9％以上測試菌量的最低藥物濃度，常規(guī)測試的方法包括培養(yǎng)基、藥物稀釋、細菌懸液接種等，與MIC測定法相同。第二十九頁，共七十四頁。八、監(jiān)控抗生素的治療效果試驗

（一）血清抗菌藥物濃度測定血清抗菌藥物濃度和抗菌藥物療效密切相關(guān)，為保證感染組織中有效濃度，血藥濃度應(yīng)該達到致病細菌MIC2倍以上。但某些抗生素治療濃度和中毒濃度相近，過高的血藥濃度引起毒性反應(yīng)，因而監(jiān)測血清抗菌藥物濃度十分重要。第三十頁，共七十四頁。微生物測定法

與瓊脂擴散法原理相似。用已知含藥濃度的紙片加到混有一定指示菌懸液濃度的傾注平板表面，35℃孵育16－20h，量取抑菌圈直徑。以抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)，含藥濃度為縱坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線找出體液測試的抑菌圈直徑相應(yīng)的含藥濃度。第三十一頁，共七十四頁。（二）血清抗菌活性測定體內(nèi)抗菌藥物活力的測定方法即為抑菌力和殺菌力測定，稱為血清殺菌活力試驗。本法是取感染患者血液分離的血清對感染部位分離確證的病原菌的抑菌和殺菌能力，為供臨床現(xiàn)用抗菌藥的療效考核評價以及感染預(yù)后的判斷提供實驗依據(jù)。第三十二頁，共七十四頁。采用體外抑菌試驗和體外殺菌試驗。無肉眼可見菌生長的血清最高稀釋管代表患者血清的抑菌力，其菌落計數(shù)等于或小于0.1％最初接種菌量的血清最高稀釋管代表患者血清殺菌力。血清抑菌力／殺菌力＞1：8常提示治療方案有效。第三十三頁，共七十四頁。九、自動化儀器檢測Viter－ATB系統(tǒng)和Microscan是半自動或全自動細菌鑒定和藥敏系統(tǒng)，通過系統(tǒng)中藥敏專家系統(tǒng)可報告分離菌的藥敏結(jié)果。第三十四頁，共七十四頁。

第三節(jié)細菌耐藥性和產(chǎn)生機制一、細菌的耐藥性對某種抗菌藥物敏感細菌變成對該藥物耐受稱細菌耐藥性。它可分為天然耐藥和獲得性耐藥，前者是通過染色體DNA突變而致，后者往往是由質(zhì)粒。噬菌體及其他遺傳物質(zhì)攜帶外來DNA片段導(dǎo)致產(chǎn)生的耐藥性。第三十五頁，共七十四頁。突變可由細菌自發(fā)產(chǎn)生或在X線等物理因素或化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生，一般只對一種或兩種相似藥物耐藥，在細菌耐藥性上不占主要地位。接合型質(zhì)粒通過接合方式，非接合型質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)換形式產(chǎn)生耐藥。第三十六頁，共七十四頁。二、細菌耐藥性的生物化學(xué)機制

1.產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶，水解藥物β－內(nèi)酰胺環(huán)而失去抗菌活性。2.產(chǎn)生鈍化酶使抗生素失活，鈍化酶有三類：①氨基糖著類鈍化酶；②氯霉素乙酸轉(zhuǎn)移酶；③紅霉素酶和其他滅活酶。第三十七頁，共七十四頁。3.青霉素結(jié)合蛋自改變導(dǎo)致對抗生素的親和力下降。4.藥物作用靶位的改變使抗生素不易結(jié)合產(chǎn)生耐藥性。5.抗菌藥物滲透障礙，如外膜蛋白減少和藥物外排作用等。6.代謝途徑的改變。第三十八頁，共七十四頁。第四節(jié)細菌耐藥性檢查方法

一、細菌耐藥性表型檢測

某些特殊菌耐藥表型檢測的方法：（一）瓊脂篩選試驗以單一藥物單一濃度檢測耐藥性稱耐藥篩選試驗，臨床上常用于對耐甲氧西林葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌，對慶大霉素或鏈霉素高水平耐藥的腸球菌。在含一定濃度測試藥物的特殊培養(yǎng)上，點種0．5麥?zhǔn)媳葷岫戎苯泳渑渲萍毦鷳乙海?5℃孵育24h后觀察平板上是否有菌落生長識要有1個菌落生長，均視為耐藥。第三十九頁，共七十四頁。（二）折點敏感試驗僅用特定抗生素濃度（敏感、中介或耐藥折點MIC）而不使用測定MIC時所用系列對倍抗生素濃度測試細菌對藥物的敏感性稱折點敏感試驗。當(dāng)選擇區(qū)分中介和耐藥折點值藥物濃度時，若兩種抗藥物濃度培養(yǎng)基均生長可判斷為耐藥；如在兩種藥物濃度均不生長則為敏感；僅在較低藥物濃度培養(yǎng)基中生長提示為中介。第四十頁，共七十四頁。

（三）雙相紙片試驗

挑取在血平板上菌落，稀釋成0．5麥?zhǔn)蠞舛染?。均勻涂布于MH平板。中央貼上阿莫西林/克拉維酸紙片，在距該紙片25mm處分別貼頭孢噻肟或頭孢曲松、頭孢他啶和氨曲南等藥敏紙片作為指示劑，35℃孵育18h觀察結(jié)果。若指示劑在朝向阿莫西林/克拉維酸方向有抑菌圈擴大的現(xiàn)象（協(xié)同現(xiàn)象），則說明待檢菌產(chǎn)生超廣譜β－內(nèi)酰胺酶。第四十一頁，共七十四頁。（四）自動化儀器自動化儀器Microscan有測定抗菌藥物抑菌的MIC值功能。原理是先測定細菌對抗生素的MIC值，當(dāng)頭孢他啶與頭孢他啶十克拉維酸的MIC比值或頭孢噻肟與頭孢噻肟十克拉維酸的MIC比值大于或等于8（即3個對倍稀釋度）即判定為此細菌產(chǎn)生ESBL。第四十二頁，共七十四頁。二、β－內(nèi)酰胺酶檢測1.頭孢哨噻吩濾紙片法用接種環(huán)挑取受試菌于商品化頭孢哨噻吩濾紙片上，于10分鐘內(nèi)由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色即陽性結(jié)果，示產(chǎn)色頭孢菌素的β－內(nèi)酰胺環(huán)被酶打開。第四十三頁，共七十四頁。2.碘淀粉測定法用接種環(huán)挑取受試菌混于青霉素溶液中，室溫下振搖30分鐘。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液變藍，繼續(xù)振搖。若檢測菌產(chǎn)生酶，則可水解青霉素β－內(nèi)酰胺環(huán)變?yōu)榍嗝顾剜邕蛩?，后者與碘結(jié)合，使碘淀粉復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色，10分鐘之內(nèi)藍色消失者為產(chǎn)酶株。第四十四頁，共七十四頁。

三、耐藥基因檢測

（一）常見的耐藥基因舉例基因耐藥抗生素細菌種類基因大小bpAnt(4’）氨基糖苷類金黃色葡萄球菌473ant（6’)-la氨基糖苷類糞腸球菌470mecAβ－內(nèi)酰胺類金黃色葡萄球菌400blaTEMβ一內(nèi)酰胺類大腸埃希菌424catD氯霉素艱難桿菌270第四十五頁，共七十四頁。（二）耐藥性基因檢測方法1.PCR擴增目標(biāo)DNA，用瓊脂糖電泳，探針雜交技術(shù)或DNA序列測定確定擴增子，標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增再用瓊脂糖電泳分析擴增子的大小。或用標(biāo)記探針雜交RFLP分析或DNA序列測定確定擴增子。第四十六頁，共七十四頁。2.PCR－RFLP分析即限制性片段長度多態(tài)性分析。擴增后的DNA用內(nèi)切酶消化，由于堿基組成不同，而產(chǎn)生不同長度的酶切片段，再經(jīng)瓊脂糖電泳，就可反映出基因組DNA堿基序列組成與已知耐藥基因序列是否存在差異。第四十七頁，共七十四頁。3．PCR－SSCP分析即單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析。PCR擴增后DNA變性形成單鏈，然后電泳，單鏈核苷酸在聚丙烯酸胺凝膠中電泳的遷移率與核苷酸的空間構(gòu)型密切相關(guān)。若單鏈核苷酸的序列發(fā)生突變，甚至是當(dāng)個堿基的變化，其空間構(gòu)型都有不同，電泳遷移率也不同。第四十八頁，共七十四頁。4．PCR－線性探針分析依據(jù)耐藥基因，設(shè)計包含常見突變位點的不同寡核苷酸探針（R探針），同時設(shè)計該基因的正常序列的探針(S探針），分別固定在硝酸纖維素膜上，與待檢株P(guān)CR擴增產(chǎn)物以平行線方式雜交。雜交后顯色，若擴增產(chǎn)物與S探針雜交陰性，與R探針雜交陽性，則為耐藥株，反之為敏感株。第四十九頁，共七十四頁。5．生物芯片技術(shù)是由固定于不同種類支持介質(zhì)上的高密度的寡核苷酸分子、基因片段或多肽分子的微陣列組成生物芯片。當(dāng)熒光標(biāo)記的靶分子與芯片上的探針分子結(jié)合后，可通過激光共聚焦熒光掃描或電荷偶聯(lián)攝像機對熒光信號的強度進行檢測，從而對雜交結(jié)果進行量化分析。第五十頁，共七十四頁。6．自動DNA測序PCR擴增待測基因后，擴增產(chǎn)物可直接測序，并準(zhǔn)確判定堿基突變的位點。第五十一頁，共七十四頁。四、特殊耐藥菌檢測

（一）耐甲氧西林葡萄球菌檢測1．定義1μg苯唑西林紙片的抑菌圈直徑＜10mm，或其MIC＞4μg／ml的金黃色葡萄球菌。對1μg苯唑西林抑菌圈直徑＜17mm，或MIC＞0．5μg／ml的凝固酶陰性葡萄球菌稱耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。第五十二頁，共七十四頁。2．臨床意義MRS不論其體外藥敏試驗結(jié)果，所有的β－內(nèi)酰胺類藥物和β－內(nèi)酰胺／β－內(nèi)酰胺酶抑制劑均無臨床療效；絕大多數(shù)的MRS常示多重耐藥，包括氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類。第五十三頁，共七十四頁。（二）耐青霉素肺炎鏈球菌檢測1.定義當(dāng)對1μg／ml苯唑西林紙片抑菌圈＜20mm或MIC＞0．06μg／ml互應(yīng)視為耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）。2.臨床意義PRSP對氨芐西林、氨芐西林／舒巴坦、頭孢克肟、頭孢唑肟，臨床治療的療效很低。但應(yīng)檢測對頭孢曲松、頭孢噻肟和美咯培南的MIC以判斷是否對這些抗生素敏感。第五十四頁，共七十四頁。（三）耐萬古霉素腸球菌檢測1．定義對30μg萬古霉素紙片抑菌圈直徑＜14mm或其MIC＞32μg／ml應(yīng)視為耐萬古霉素腸球菌（VRE）。2．臨床意義對青霉素敏感的VRE可用青霉素和慶大霉素聯(lián)合治療，若對青霉素耐藥而不是高水平耐氨基糖苷類可用壁霉素＋慶大霉素。第五十五頁，共七十四頁。（四）超廣譜β－內(nèi)酰胺酶

腸桿菌科細菌檢測

1．定義超廣譜β－內(nèi)酰胺酶是水解青霉素、頭孢菌素及單胺類的酶，主要由克雷伯菌和大腸埃希菌、腸桿菌等細菌產(chǎn)生。第五十六頁，共七十四頁。當(dāng)通過篩選法時對頭孢泊肟、頭孢他啶（10ug／片）抑菌圈≤22mm或氨曲南、頭孢噻肟（30ug／片）≤27mm的菌株經(jīng)頭孢他啶（30ug／片）、頭孢他啶／克拉維酸（30／10ug）；頭孢噻肟30ug、頭孢噻肟／克拉維酸（30／10ug）二組確證試驗。第五十七頁，共七十四頁。其結(jié)果為二組中任何一組藥物，加克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌圈相比，增大值35mm時即判定為產(chǎn)ESBL菌株。2．臨床意義產(chǎn)ESBL克雷伯菌和大腸埃希菌不論其體外藥物敏感試驗結(jié)果如何，對青霉素、頭孢菌素和氨曲南治療無效。第五十八頁，共七十四頁。第五節(jié)抗分枝桿菌藥物敏感性試驗

一、抗分枝桿菌藥物第一線藥物為異煙、利福平、吡酸胺、乙胺丁醇和鏈霉素；第二線藥物包括對氨基水楊酸、乙硫異煙胺、環(huán)絲氨酸、卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素和利福布丁。第五十九頁，共七十四頁。二、結(jié)核分枝桿菌和緩慢生長分枝桿菌體外抑菌試驗（一）結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗指征首次分離的分枝桿菌需做藥敏試驗，有助于合理用藥和監(jiān)測藥物敏感性。另外經(jīng)過三個月正規(guī)治療，標(biāo)本分離培養(yǎng)仍為陽性患者，或感染的嚴重疾患（如播散性結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎）以及來自高耐藥流行區(qū)的患者，均須做體外藥敏試驗。第六十頁，共七十四頁。（二）體外藥敏試驗方法由于分枝桿菌生長緩慢，在分枝桿菌生長前，藥物已擴散至培養(yǎng)基中，不能有效影響其生長。故常規(guī)用于需氧或兼性厭氧菌的藥敏試驗方法不適用結(jié)核分枝桿菌。有比例法、放射同位素法、絕對濃度法、和耐藥率法等四種方法。第六十一頁，共七十四頁。1．培養(yǎng)基Middlebrook7H10瓊脂添加油酸、白蛋白、葡聚精觸酶是慢生菌比例法的推薦培養(yǎng)基；2．藥敏試驗藥物抗菌藥物直接來自廠商，不能用治療的抗結(jié)核藥物作為試驗用藥。藥物原液濃度至少為1000μg/ml，－20℃貯存期6個月。第六十二頁，共七十四頁。3．細菌接種直接比例法藥敏試驗采用涂片陽性患者標(biāo)本；接種物是充分消化、無雜菌污染的標(biāo)本,接種菌液的稀釋方法如下：抗酸染色（1000×）未見細菌，熒光染色（450×）＜25，菌液不稀釋?？顾崛旧?000×）l－10，熒光染色（450×）25－250，菌液稀釋或10－1，10－2。第六十三頁，共七十四頁。觀察含藥瓊脂格細菌生長情況用以＋～4＋表示：（＋：50－100個菌落；2＋：100－200個菌落；3＋：200－500個菌落；4＋：500個以上菌落）。若測試菌生長數(shù)大于對照格菌落數(shù)1％，即判讀為耐藥菌。第六十四頁，共七十四頁。6．質(zhì)量控制結(jié)核分枝桿菌H37RVATCC27294為一線、二線藥的敏感質(zhì)控菌株；H37RVATCC35820為鏈霉素耐藥質(zhì)控菌株；H37RVATCC35822為異煙耐藥質(zhì)控菌株；H37RVATCC35826為環(huán)絲氨酸耐藥質(zhì)控菌株；H37RVATCC35827為卡那霉素耐藥質(zhì)控菌株；第六十五頁，共七十四頁。三、快速生長分枝桿菌體外藥敏試驗快速生長分枝桿菌是在合適的固體培養(yǎng)基上孵育5－7天內(nèi)能肉眼可見細菌菌落生長。人類感染密切相關(guān)的有3種：偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌龜分枝亞種和膿腫亞種。藥物敏感試驗操作方法基本同需氧和兼性厭氧菌。第六十六頁，共七十四頁。第六節(jié)厭氧菌體外抑菌試驗由于厭氧菌感染系內(nèi)源性感染，厭氧菌藥物敏感性穩(wěn)定，一般不做體外藥敏試驗。下述情況應(yīng)考慮藥敏試驗：①明確厭氧菌引起的嚴重感染；②已確證的厭氧菌感染，經(jīng)驗性的選藥治療未能奏效；③需長期用藥的厭氧菌感染。第六十七頁，共七十四頁。厭氧菌體外藥敏試驗的基本原理和方法與需氧菌相同，只是在培養(yǎng)基、操作環(huán)境和培養(yǎng)條件等應(yīng)根據(jù)厭氧菌的特定需要變動。培養(yǎng)基為布氏血瓊脂再加人補充劑5μg/ml氯化血紅素,5％脫纖維羊,1μg/mlV