菌種冷凍保藏

/菌種冷凍保藏菌種保藏對于生物制藥是一項重要的基礎工作.要使菌種長期保藏，且其生物學性狀和遺傳性質不變,必須選擇適宜的載體和更穩(wěn)定的保藏方法。菌種保藏無論哪種方法,其原理都是創(chuàng)造一個抑制細胞代謝的環(huán)境,即低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)，使新陳代謝活動處于高度靜止狀態(tài)。在眾多的菌種保存方法中，相對所需保藏環(huán)境，冷凍真空干燥法（即冷凍管保藏)是目前保藏方法中應用最為廣泛最為有效的一種.1、冷凍真空干燥保藏原理冷凍真空干燥保藏法可使細胞或孢子水分在凍結狀態(tài)下直接升華而干燥。冷凍管保藏的三要素:真空—-降低水的蒸汽壓以加速水分的蒸發(fā)；冷凍——使水蒸氣冷凝以減輕真空泵負荷，加速干燥；低溫——達到進一步加速干燥的目的.2、冷凍干燥的優(yōu)點：對微生物的生物活性影響小;所得干粉疏松,溶解性好；水分含量低。由于同時滿足菌種保藏三要素,使微生物始終處在低溫、干燥、缺氧的條件下，能克服傳代、沙土管簡單保藏方法的不足，保藏菌種范圍廣、時間長（保藏期可達數(shù)年至十數(shù)年）、存活率高、保存過程不易失活和退化等。3、主要步驟為:３.１將待保藏菌種的細胞或孢子懸浮于保護劑（如脫脂牛奶）中；3.2在低溫(—4５℃以下）下使微生物細胞快速冷凍；3.3在真空條件下使冰升華,以除去大部分的水分；3．4封口使菌種始終處于真空缺氧狀態(tài);３。5冷藏創(chuàng)造低溫、干燥的保藏環(huán)境。4、材料菌株:篩選出具有優(yōu)良性能的菌株。試劑：2％HCl；脫脂牛奶（20%乳液）、器具:培養(yǎng)皿、接種環(huán)、2５0ｍl三角瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、牛皮紙、酒精噴燈、恒溫培養(yǎng)箱、酒精棉球、淚滴型安瓿管、標簽、長頸毛細玻璃管、普通棉、凍干機。培養(yǎng):種子液體培養(yǎng)基、斜面或平板培養(yǎng)基。５、主要流程備淚滴型安瓿管→備脫脂乳→制菌懸液→分裝→預凍→真空干燥→封管→保藏6、操作方法６.1準備安瓿管選取質地均勻、無毛點、無氣泡的中性硬質玻璃專用菌種冷凍管,形狀為長頸球形底（亦稱淚滴型安瓿管)，規(guī)格約外徑６～7。5mm,長１05mm，球部直徑9～1１ｍm，壁厚0．6～1.2ｍm.先用２％鹽酸浸泡8~10h,再經(jīng)自來水沖洗多次,用蒸餾水涮洗2～3次，烘干；管口塞上棉花,用牛皮紙包扎,１.０5kｇ／cm２,１２1℃滅菌３０分鐘,取出置3７℃孵育24小時，重復滅菌一次，10５～1１0℃烤干（有硅膠指示劑的要使硅膠達到深藍色)，置干燥器內備用。6.2制備脫脂乳取市售新鮮、清潔、無抗生素污染的原牛奶300ml煮沸，在500０r／mｉn下離心１０分鐘，除去上層奶皮、油脂，吸取下層奶液，經(jīng)脫脂棉過濾，如此反復3次脫去脂肪,然后分裝入兩個２５0ｍl三角瓶中，加棉塞并用牛皮紙包頭、扎牢，在115℃25ｍiｎ高壓蒸汽滅菌，冷卻后做無菌試驗,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。也可以購買袋裝或盒裝的超高溫滅菌優(yōu)質脫脂牛奶直接使用，無需再滅菌。還可將脫脂奶粉制成還原乳，配成20％乳液，同上滅菌后使用。如滅菌后放置時間超過24小時，則應棄用。6。３菌種準備菌種要求為篩選得到的優(yōu)質良種，生長良好的純種，孢子新鮮，菌齡以處于穩(wěn)定期或超過對數(shù)生長期為好,有利于延長凍干存活期。放線菌斜面種子培養(yǎng)７～10天,生長飽滿，孢子豐富，且無菌檢查合格。６。４制菌懸液形成孢子的鏈霉菌要盡可能保存孢子，避免基質菌絲體.每支長好的斜面加5～10ml脫脂牛乳，用接種環(huán)將孢子輕輕刮下(注意勿刮起培養(yǎng)基)，或震蕩洗下孢子層，制成菌懸液.一般要求制成的孢子濃度達１08～10１0個,高濃度的菌懸液有利菌種保藏。多年后存活率仍高。

6.5分裝菌懸液制備完成后要盡快分裝.分裝冷凍管時用滅菌的長頸毛細吸管吸取菌懸液,插入預先的冷凍管球形底部，每支冷凍管分裝量約0。2~0.5毫升，分裝后向管頸部塞入無菌脫脂棉,以不緊為宜.并貼上標簽，同時配制１支1%氯化鈷牛奶溶液干燥指示管。分裝時間要短，要盡快進入凍結。6.6預凍因為迅速超低溫預凍可保持菌體細胞結構成份原狀，利于細菌存活。故將分裝好的冷凍管及指示管置于低溫冰箱冷凍室—70℃下快速冷凍過夜.無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體CO2）酒精液或干冰丙酮液,溫度可達－７0℃.也可用液氮。將冷凍管插入冷凍劑,只需冷凍４-5分鐘，即可使懸液結冰。也可用液氮預凍。還可用低溫冰箱－８０℃預凍1～2小時后轉入冷凍真空干燥.6．7

冷凍真空干燥真空冷凍干燥器有成套的裝置出售（長藥廠新近成立菌種中心,購有該機）。按其方法操作。冷凍干燥機要先開機預冷３0分鐘以上,再根據(jù)冷凍干燥機的水分蒸發(fā)能力，確定一次放入的冷凍管數(shù)量.將預凍好的冷凍管及指示管于次日取出迅速放入已預冷的冷凍干燥機的干燥箱內，開動真空泵進行一級真空抽干,待指示管出現(xiàn)由粉紅色變全蘭色時,再進行二級抽干12h。二級真空干燥既保持菌體細胞干燥度,又避免細胞反復凍結造成保存中菌體死亡，因而能更長期保存菌種，并能提高其存活率,又不會發(fā)生菌株的變異冷凍干燥,時間一般為8~2０小時。6.8干燥的確認和停機終止干燥時間應根據(jù)下列情況判斷：①冷凍管內菌懸液呈酥塊狀或松散片狀；②真空度接近空載時的最高值;③選用1～2支對照管,其水份與菌懸液同量,其干燥后視為完結。確認菌懸液是否已經(jīng)干燥的另一方法是：一看真空度,二看冷凍室溫度.當水分已經(jīng)蒸發(fā)完,即水蒸汽分壓接近零時,真空度將達到最高值而不再上升；由于蒸發(fā)是一個吸熱過程，在整個冷凍干燥過程中冷凍室的溫度會維持很低，使菌懸液一直處于凍結狀態(tài),當沒有水分繼續(xù)蒸發(fā)后,冷凍室不再吸熱，溫度開始自然上升.確認干燥后，要先開啟冷凍室的進氣閥,讓真空釋放，然后停泵，打開冷凍室,將冷凍管取出。為了確保冷凍管內的菌粉不被污染,在冷凍室進氣口應裝有空氣過濾器（如塞滅菌棉）.6。９封管將取出的冷凍管,裝入抽真空的耐壓橡皮歧管上抽氣，待真空度抽至1。33Ｐa（0。01毫米汞拄)后，再采用酒精噴燈火焰于冷凍管頸部棉塞以下熔封處拉細熔封，封管好后,要用高頻火花器檢查各冷凍管的真空情況。如果冷凍管頂部呈現(xiàn)灰藍色光,即證明保持著真空。檢查時高頻電火花器要射向冷凍管的上半部。6.1０冷凍保藏封管合格的冷凍管置冰箱－２0℃避光處作長期保存。較低的保藏溫度(—20～—７0℃）對于菌種的長期穩(wěn)定更好。7.注意事項7.１淚滴型安瓿瓶不易進水，清洗時拿少量安瓿瓶慢慢傾斜，使其管內浸入鹽酸；用蒸餾水洗時亦如此;塞棉花時注意松緊適宜,利于防止污染及抽真空。7.2脫脂乳最好在使用頭一天配制好滅菌；滅菌需注意溫度不能過高，在115℃２５min分鐘即可;當壓力降為0后，應盡快將其拿出,防止高溫破壞其成分（滅菌后顏色發(fā)生變化的不可用)。7。3分裝時,需三個人配合,一個吸菌液,另一個塞棉花,還有一個貼標簽.７.4采用酒精噴燈進行封管時，燒的溫度要適宜。封管后不要立即放在臺面上，以防受冷撕裂。附圖：淚滴型安瓿管長頸毛細玻璃管棉塞棉塞熔封區(qū)熔封區(qū)標簽處標簽處裝液區(qū)裝液區(qū)多頭岐管真空表真空表抽真空抽真空閥門閥門連接冷凍管的硅膠管連接冷凍管的硅膠管附：1、冷凍保藏改進方法（一）因真空冷凍干燥器價格比較昂貴，通?？股厣a(chǎn)廠都采用自制的簡單易行辦法,可達到同樣的目的。即：１。真空干燥：取出預凍好的冷凍管，置于如沙土管制備能抽真空的玻璃干燥器內（干燥器四周置冰塊或無水乙醇、冰鹽水放低溫冰箱或普通冰箱冷凍室事先冷至—２1℃±），迅速抽真空。其間不斷更換冰塊或冷凍液。能將該玻璃干燥器置于冰柜抽真空更好。連續(xù)抽氣6~８ｈ即可。(干燥器蓋底接觸處需事先均勻涂抹凡士林石臘,以防微小漏氣。）2。封管：自制一個帶多頭的岐管，主管連接真空泵，每個岐管連接都采用可抽真空的耐壓硅膠管,能裝上多支冷凍管即可。硅膠管３．還可用自制簡易的冷凍干燥機制備冷凍管：如圖:硅膠管真空保溫桶(液氮罐)真空保溫桶(液氮罐)液氮冷凍真空室

(放冷凍干燥管)硅橡膠密封圈進氣閥冷凝室真空表至真空泵至真空泵2、冷凍保藏改進方法（二）冷凍管由傳統(tǒng)的玻璃管改為０。5ｍl帶蓋塑料管（維奧即采用此法可保藏大量的錐形塑料管,其材質不詳，能耐高溫滅菌，蓋為按壓式)。方法：⑴將塑料管置耐高壓盒器內，用雙層牛皮紙包好,高壓蒸汽121℃20ｍiｎ消毒，放烤箱80℃烤干。⑵在凈化工作臺內將脫脂牛奶洗下的孢子懸液用長頸毛細吸管加到塑料管的底部,每只0．2mｌ左右，切記不要將牛奶污染離心管口。⑶將加好菌液的塑料管置于管架上放入盒器內置-2０℃冰箱預凍,預凍好后將其放置到真空冷凍干燥機干燥箱內凍干。⑷凍干后在凈化工作臺內壓好塑料管蓋,不抽真空,用封口膜封塑料管口.用記號筆分別標簽，放-２0℃冰箱保存.即可。該改良法優(yōu)點有：