如何解析蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

關(guān)于如何解析蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)第1頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。問題的提出：第2頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）蛋白質(zhì)的兩性電離一、理化性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。

*蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint,pI)§6蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其分離純化

第3頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點第4頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可達100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素：顆粒表面電荷(電荷層）水化膜第5頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉第6頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固

*蛋白質(zhì)的變性(denaturation)在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。第7頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月

造成變性的因素如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質(zhì)——破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。第8頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月

應用舉例臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。

第9頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變：①物理性質(zhì)：旋光性改變，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學性質(zhì)：官能團反應性增加，易被蛋白酶水解。③生物學性質(zhì)：原有生物學活性喪失，抗原性改變。若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復或部分恢復其原有的構(gòu)象和功能，稱為復性(renaturation)。變性蛋白質(zhì)的復性：第10頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性第11頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月*蛋白質(zhì)沉淀在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。*蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。

第12頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）蛋白質(zhì)的紫外吸收由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。第13頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）蛋白質(zhì)的呈色反應⒈茚三酮反應(ninhydrinreaction)

蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。⒉雙縮脲反應(biuretreaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。第14頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月二、蛋白質(zhì)的分離和純化（一）透析及超濾法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。*超濾法

應用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。第15頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀

*使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質(zhì)沉淀。第16頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月*

免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。第17頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）電泳蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)。第18頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳的類型

目前電泳的類型很多，最常見的是區(qū)帶電泳，由于在支持物上電泳時蛋白質(zhì)混合物被分離成若干區(qū)帶而得名。第19頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月區(qū)帶電泳按其支持物的物理性狀不同可以分成幾類：①濾紙電泳和薄膜電泳(如醋酸纖維薄膜電泳和聚酰胺薄膜電泳)；②粉末電泳，支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉或硅膠粉等，粉末與適當?shù)娜軇┱{(diào)和，鋪設(shè)成平板；第20頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月③凝膠電泳，最常用的支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠，前者適于分離蛋白質(zhì)和多核苷酸，后者適于分離核酸，這兩種凝膠電泳的分辨率都很高，

-++—第21頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第22頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis)第23頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月記住這幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學研究的重要技術(shù)。第24頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）層析層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的。第25頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第26頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離。凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。親和層析(affinitychromatography)是利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力，也即生物學親和力（底物和酶，抗原與抗體，酶與抑制劑，受體與底物等），建立起來的一種有效的純化方法。它經(jīng)常只需要經(jīng)過一步的處理即可將某種所需蛋白質(zhì)從復雜的混合物中分離出來，并且純度相當高。第27頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第28頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月親和層析第30頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）超速離心

ultracentrifugation*既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。*蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)。第31頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)純化方法總結(jié)：根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的性質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)的方法：①分子大??；②溶解度；③電荷；④吸附性質(zhì)；⑤對配體分子的生物學親和力等。

透析離心沉淀電泳層析第32頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月一、蛋白質(zhì)含量測定

總蛋白質(zhì)含量測定有兩類方法：

1、利用蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)，如折射率、比重、紫外吸收等測定。

2、利用化學方法測定蛋白質(zhì)含量，如微量凱氏定氮、雙縮脲反應、Folin-酚試劑法(又名Lowry法)。這兩類方法各有優(yōu)缺點，選用何種方法測定蛋白質(zhì)含量，可根據(jù)實驗要求及實驗室條件進行選擇。原理都是利用蛋白質(zhì)的成色反應或紫外吸收的性質(zhì)，通過分光光度法來測定?！?蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定第33頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月1.凱氏定氮法是經(jīng)典的標準方法，用濃硫酸消化蛋白質(zhì)分解出氨，測定氨的含量，除以16%，就得出蛋白質(zhì)的含量。第34頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月2.雙縮脲法蛋白質(zhì)在堿性溶液中，能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用來測定蛋白質(zhì)的濃度。凡含有雙縮脲相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)均能參與反應，常用于需要快速但并不需要十分精確的測定。第35頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月3.Lowry法(Folin-酚法)

Folin-酚試劑由甲試劑與乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成。機理：蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡(luò)合物（組成不清楚）。第36頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月Lowry法目前實驗室多用Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量。此法的優(yōu)點是操作簡單，迅速，不需特殊儀器設(shè)備，靈敏度高，較紫外吸收法靈敏10—20

倍，較雙縮脲法靈敏100倍，反應約在15min內(nèi)有最大顯色，并至少可穩(wěn)定幾小時。其不足之處是此反應受多種因素干擾。在測試時應排除干擾因素或做空白試驗消除。

第37頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月4.紫外吸收法

由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值(A280)與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。第38頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月紫外吸收法的優(yōu)缺點：優(yōu)點：簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中(特別是在柱層析分離中)廣泛應用。缺點：(1)對于測定那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差，(2)若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。第39頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月5.考馬斯亮藍染色法蛋白質(zhì)的存在會影響酸堿滴定中所用某些指示劑的顏色變化，從而改變這些染料的光吸收。在此基礎(chǔ)上，發(fā)展蛋白質(zhì)染色測定方法。涉及的指示劑有甲基橙、考馬斯亮藍、溴甲酚綠和溴甲酚紫，目前廣泛使用的染料是考馬斯亮藍?？捡R斯亮藍R-250和蛋白質(zhì)通過范德瓦爾鍵結(jié)合，呈藍色，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的染色符合比爾定律。2—5min即呈現(xiàn)最大光吸收，至少穩(wěn)定1h。本方法可允許的測定范圍是2—20ug蛋白質(zhì)。受蛋白質(zhì)的特異性影響較小，除組蛋白外，其他不同種類蛋白質(zhì)的染色強度差別不大。第40頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月6.膠體金測定法膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體，呈洋紅色，遇蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色，顏色改變與蛋白質(zhì)有定量關(guān)系，是幾種方法中靈敏度最高的，檢測量是ng水平。第41頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月7.某一特定蛋白質(zhì)的含量測定通常要用具有高度特異性的生物學方法。具有酶或激素性質(zhì)的蛋白質(zhì)可以利用它們的酶活性或激素活性來測定含量。有些蛋白質(zhì)雖然沒有酶或激素那樣特異的生物學活性，但是大多數(shù)蛋白質(zhì)當注入適當?shù)膭游镅褐袝r，會產(chǎn)生抗體。因此，利用抗體—抗原反應，也可以測定某一特定蛋白質(zhì)的含量。第42頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月二、蛋白質(zhì)純度的鑒定蛋白質(zhì)純度鑒定通常采用物理化學的方法：（1）電泳：目前采用的電泳分析有等電聚集、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和SDS—PAGE、毛細管電泳等。純的蛋白質(zhì)在一系列不同的pH