第五章基因工程育種微生物遺傳育種(與“基因”有關(guān)的文檔共65張)

第五章基因工程育種微生物遺傳育種第一頁，共65頁。2奠定基因工程的三項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)DNA的特異切割

Smith和Nathans獲1978年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)DNA的分子克隆

Berg（1972）將猴病毒SV40DNA與λ噬菌體基因融合，成功構(gòu)建重組DNA；

Cohen和Boyer（1973）將質(zhì)粒pSC101與R的tetrkmr基因融合，并將重組DNA轉(zhuǎn)化E.coli，首次實(shí)現(xiàn)了DNA的分子克隆。DNA的快速測(cè)序

Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化學(xué)法DNA快速測(cè)序技術(shù)

1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)：Berg,Gilbert,Sanger第二頁，共65頁。3分離或合成基因；通過體外重組將基因插入載體；將重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞；擴(kuò)增克隆的基因；篩選重組體克??；對(duì)克隆的基因進(jìn)行鑒定或測(cè)序；控制外源基因的表達(dá)；得到基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物基因工程操作的主要步驟第三頁，共65頁。4第一節(jié)基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)一、限制性核酸內(nèi)切酶restrictiveendonuclease核酸酶：通過切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的酶。核糖核酸酶(RNase)與脫氧核糖核酸酶(DNase)核酸外切酶：exonuclease核酸內(nèi)切酶：endonuclease第四頁，共65頁。51、寄主控制的限制與修飾作用（1）寄主控制的限制作用(Restriction)作用：破壞外源DNA，使之迅速降解機(jī)制：限制性核酸內(nèi)切酶，識(shí)別特定的堿基序列并進(jìn)行切割（2）寄主控制的修飾作用(Modification)作用：保護(hù)自身的DNA，使之不受限制機(jī)制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。第五頁，共65頁。62、限制性核酸內(nèi)切酶的類型特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型功能限制、修飾限制限制、修飾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3種不同亞基單一成分2種不同亞基所需輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM識(shí)別序列EcoB:TGA(N)8TGCT4~8bp,旋轉(zhuǎn)對(duì)稱EcoPI:AGACC切割位點(diǎn)距識(shí)別位點(diǎn)至少1000kb處隨機(jī)切割在識(shí)別序列內(nèi)（或附近）距識(shí)別位點(diǎn)3’-端24~26bp處第六頁，共65頁。73、限制性核酸內(nèi)切酶的命名用產(chǎn)生菌的屬名一個(gè)字母(大寫，斜體)＋種名兩個(gè)字母(小寫，斜體)[＋菌株名一個(gè)字母]＋編號(hào)（羅馬數(shù)字）[例]EcoRI,EcoRII：從E.coli

Rye13菌株中獲得HindI，HindII，HindIII：從Haemophilusinfluenzae

d菌株獲得第七頁，共65頁。84、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特征（1）識(shí)別序列：一般4~8bp，具有二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸，序列呈回文結(jié)構(gòu)(palindromicstructure)例：AluI：5’-AGCT-3’

AsuI：5’-GGNCC-3’

PstI：5’-CTGCAG-3’第八頁，共65頁。9（2）切割：產(chǎn)生平末端：SmaI5’-CCC↓GGG-3’3’-GGG↑CCC-5’產(chǎn)生3’-OH單鏈粘性末端:PstI5’-CTGCA↓G-3’3’-G↑ACGTC-5’產(chǎn)生5’-P單鏈粘性末端:EcoRI5’-G↓AATTC-3’3’-CTTAA↑G-5’第九頁，共65頁。10第十頁，共65頁。11酶剪切條件需要鎂離子的存在，特定的酸堿度和離子強(qiáng)度。輔助條件：DTT、牛血清蛋白。抑制因子：雜蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、高鹽濃度。其它：甘油濃度等可以改變對(duì)序列的識(shí)別。第十一頁，共65頁。12狹義：來源不同但識(shí)別和切割相同序列的酶。

HpaⅡ與MspI:CCGG廣義：來源于不同物種但能識(shí)別相同DNA序列的限制性內(nèi)切酶，切割位點(diǎn)可以相同也可以不同異功酶（neoschizomer）：SmaI和XmaI，它們均識(shí)別CCCGGG，但前者切后產(chǎn)生鈍末端，后者切后產(chǎn)生粘性末端。（3）同裂酶(isoschizomers)第十二頁，共65頁。13

兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶

BamHI:G↓GATCCBglⅡ：T↓GATCA（4）同尾酶(isoocaudamer)第十三頁，共65頁。14二、DNA連接酶（DNAligase）

催化兩個(gè)雙鏈DNA片段相鄰的5’-P與3’-OH之間形成磷酸二酯鍵。1、體外DNA連接連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段連接具有平末端的DNA片段先在DNA片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，再行連接第十四頁，共65頁。152、連接用酶（1）T4DNA連接酶：催化反應(yīng)需要Mg+2,ATP催化粘性末端連接，效率較高催化平末端連接（2）大腸桿菌連接酶催化反應(yīng)需要NAD+只能催化粘性末端的連接第十五頁，共65頁。16減少載體自身連接的方法：脫磷酸；雙酶切第十六頁，共65頁。17三、反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)催化以mRNA為模板的cDNA的合成cDNA（complementaryDNA）：互補(bǔ)于mRNA的DNA片段內(nèi)含子外顯子

DNA↓轉(zhuǎn)錄前體mRNA↓修飾成熟mRNA第十七頁，共65頁。18Reversetranscription第十八頁，共65頁。19四、末端轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase)催化將脫氧核苷酸連接至DNA分子末端的3’-OH上向3’-單鏈末端上連接：Mg+2向平末端上連接：Co+2五、TaqDNA聚合酶來源：棲熱水生菌Thermusaquaticus第十九頁，共65頁。20第二節(jié)基因的克隆載體(cloningvector)克隆載體：以繁殖DNA片段為目的的載體克隆載體的基本要求在細(xì)胞中能進(jìn)行自主復(fù)制，為松弛型;具有多種限制酶的單一切割位點(diǎn)，便于外源DNA的插入，并且插入后不影響載體的復(fù)制;容易進(jìn)入宿主細(xì)胞，進(jìn)入效率越高越好，并且容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來，以便于重組操作;具有可供選擇的遺傳標(biāo)記第二十頁，共65頁。21一、質(zhì)粒載體1、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性

(1)環(huán)狀雙鏈質(zhì)粒DNA的構(gòu)型共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA):兩條鏈均保持完整的環(huán)狀構(gòu)型，通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型開環(huán)DNA(ocDNA)：一條鏈保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口，即OC構(gòu)型線形DNA(lDNA)：質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶的切割后，發(fā)生雙鏈斷裂，稱L構(gòu)型第二十一頁，共65頁。22第二十二頁，共65頁。23(2)表型效應(yīng)性別：F，SCP1抗生素類物質(zhì)合成：SCP1，Col抗藥性：R分解性質(zhì)粒：CAM(樟腦)，TOL(甲苯)酶的合成：Rye13隱蔽性質(zhì)粒(crypticplasmid)：2m第二十三頁，共65頁。24(3)質(zhì)粒的分類分子量：大型質(zhì)粒：MW>40×106d

小型質(zhì)粒：MW<10×106d復(fù)制類型嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringent)：1~3copies/cell

松弛型質(zhì)粒(relaxed)：10~60,ormore第二十四頁，共65頁。25接合類型接合型質(zhì)粒(conjugative)

非接合型質(zhì)粒(nonconjugative)質(zhì)粒的不親和性(incompatibility)

在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。同一不親和群：不能共存于同一細(xì)胞中不同的不親和群：能共存于同一細(xì)胞中第二十五頁，共65頁。26(4)質(zhì)粒的命名①質(zhì)粒名以三個(gè)英文字母加阿拉伯?dāng)?shù)字表示

pUC19plasmid發(fā)現(xiàn)者或?qū)嶒?yàn)室名編號(hào)(小寫）（大寫）第二十六頁，共65頁。27②為了說明質(zhì)粒的來源、性狀，有時(shí)需要標(biāo)出缺失、插入等pXY9109：FDtraA3(63.1-64.0kb)pXY2101：pXY101W4[0kb:k12hisA:1.5kb](5)與質(zhì)粒有關(guān)的菌株的命名E.colik12:E.coliC600：k12(F-)(l-)thrleutonAlacYthiE.coliXY100：C600(F’155)(pXY1234)第二十七頁，共65頁。282、質(zhì)?？寺≥d體（1）特性具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn);具有較小的相對(duì)分子量（1~200kb）,克隆外源DNA片段一般不超過15kb；具有較高的拷貝數(shù)（10~200）；具有便于選擇的標(biāo)記；易于導(dǎo)入細(xì)胞；具有安全性第二十八頁，共65頁。29（2）克隆質(zhì)粒載體第二十九頁，共65頁。30第三十頁，共65頁。31質(zhì)粒分離的步驟：粗提精提第三十一頁，共65頁。32氯化銫梯度離心法：有效地去除蛋白質(zhì)、RNA、染色體DNA、受損質(zhì)粒。第三十二頁，共65頁。33二、l噬菌體克隆載體1、優(yōu)點(diǎn)遺傳學(xué)背景十分清楚載體容量大，~23kb具有較高的感染效率2、類型插入型載體:較小片段DNA的插入（10kb以內(nèi)）；取代型載體：較大片段DNA的插入；重組DNA分子大小為l噬菌體DNA的75～105％；野生型λDNA為48kb，λ噬菌體的包裝上限是51kb。編碼必要基因的DNA區(qū)段占28kb，因此λ載體克隆外源DNA的理論極限值應(yīng)是23kb。第三十三頁，共65頁。34插入型載體第三十四頁，共65頁。35取代型載體第三十五頁，共65頁。363、l噬菌體克隆載體的導(dǎo)入轉(zhuǎn)染：用λ重組體DNA分子直接感染大腸桿菌，使之侵入寄主細(xì)胞內(nèi)。效率低：未經(jīng)任何基因操作處理的新鮮制備的λDNA，其典型的轉(zhuǎn)染效率也僅為105～106噬菌斑/微克λDNA，體外連接的結(jié)果，轉(zhuǎn)染效率便下降到了104～103左右。λDNA的體外包裝：在離體條件下，將重組體DNA包入噬菌體等病毒顆粒，形成有感染功能的病毒載體。第三十六頁，共65頁。37三、柯斯質(zhì)粒載體(cosmidvector)

由l噬菌體的粘性末端和質(zhì)粒構(gòu)建而成。含有來自質(zhì)粒的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、抗藥性標(biāo)記、一個(gè)或多個(gè)限制酶單一位點(diǎn)，來自l噬菌體粘性末端的DNA片段（cos位點(diǎn)）。第三十七頁，共65頁。38優(yōu)點(diǎn)具有l(wèi)噬菌體的特性，在體外包裝后具有噬菌體的高效感染力；具有質(zhì)粒DNA的復(fù)制方式；具有克隆大片段外源DNA的能力(45kb)；具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力第三十八頁，共65頁。39柯斯克?。╟osmidcloning）應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)第三十九頁，共65頁。40第三節(jié)基因工程的基本操作一、目的基因的獲得1、從供體細(xì)胞的DNA中分離

（基因文庫的構(gòu)建）基因文庫：某生物染色體基因組各DNA片段的克隆總體。如“鳥槍法”(ShotgunMethod)第四十頁，共65頁。41步驟提取染色體DNA限制酶解電泳分離與載體連接導(dǎo)入宿主篩選陽性克隆第四十一頁，共65頁。422、從mRNA合成cDNA(cDNA文庫構(gòu)建）所謂cDNA文庫是指某生物體全部mRNA的cDNA克隆總體。第四十二頁，共65頁。43步驟提取mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈合成cDNA第二鏈與載體連接導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩選陽性克隆第四十三頁，共65頁。443、PCR體外擴(kuò)增目的基因PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：利用特殊的DNA聚合酶，在體外擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的特定DNA區(qū)段的方法。(1)PCR組成：含目標(biāo)DNA序列的模板DNA寡核苷酸引物DNA聚合酶：Taq或PfudNTPs緩沖體系和金屬離子第四十四頁，共65頁。45(2)PCR過程變性(denaturation)：90℃以上退火(annealing)：40~60℃延伸(extension)：72℃

如此進(jìn)行20~40個(gè)循環(huán)，DNA量擴(kuò)增106~107倍。第四十五頁，共65頁。46第四十六頁，共65頁。47第四十七頁，共65頁。484、基因的化學(xué)合成主要應(yīng)用于已知核苷酸序列的、分子量較小的基因的制備。通常先合成一定長度的具有特定序列的寡核苷酸片段，然后再組裝成完整的基因。方法主要有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法和自動(dòng)化法等。第四十八頁，共65頁。49二、目的DNA與載體的連接1、粘性末端連接2、平齊末端連接3、同聚末端連接4、人工接頭連接第四十九頁，共65頁。50三、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染2、體外包裝與感染3、電穿孔法electroporation常用宿主系統(tǒng)第五十頁，共65頁。51過程：連接反應(yīng)的混合液+感受態(tài)細(xì)胞;

冰浴10至30分鐘;

熱休克0.5至2分鐘;

加入培養(yǎng)基37C振蕩培養(yǎng)1小時(shí);

涂布平板，培養(yǎng)。第五十一頁，共65頁。52四、重組體的篩選與鑒定1、遺傳學(xué)方法：檢測(cè)選擇性標(biāo)記2、核酸雜交方法：檢測(cè)目的基因3、免疫化學(xué)方法：檢測(cè)目的基因產(chǎn)物4、直接檢出法：檢測(cè)目的基因產(chǎn)物第五十二頁，共65頁。53五、DNA序列測(cè)定Sanger雙脫氧鏈終止法1、試劑引物模板：待測(cè)序DNADNA聚合酶dNTPsddNTP第五十三頁，共65頁。542、測(cè)序反應(yīng)3、制備聚丙烯酰胺凝膠3、凝膠加樣4、電泳5、結(jié)果記錄與分析第五十四頁，共65頁。55第五十五頁，共65頁。56第五十六頁，共65頁。57六、外源基因的表達(dá)影響表達(dá)的因素細(xì)胞中基因拷貝數(shù)：拷貝數(shù)多，產(chǎn)物多轉(zhuǎn)錄水平：啟動(dòng)子與RNA多聚酶的統(tǒng)一翻譯水平：mRNA的核糖體結(jié)合部位與宿主核糖體的統(tǒng)一；密碼子與tRNA的統(tǒng)一；mRNA的穩(wěn)定性外源基因的插入方向轉(zhuǎn)錄后的修飾及翻譯后的修飾第五十七頁，共65頁。58第四節(jié)基因工程的實(shí)際應(yīng)用微生物發(fā)酵病毒疫苗哺乳動(dòng)物蛋白（人源蛋白藥物）轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物環(huán)境生物技術(shù)基因診斷與基因治療蛋白質(zhì)工程（定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化）代謝工程第五十八頁，共65頁。59復(fù)習(xí)題1、何謂基因工程？基因工程操作主要步驟。2、何謂限制性核酸內(nèi)切酶？Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶有何特點(diǎn)？3、克隆載體的基本要求。4、質(zhì)粒的表型效應(yīng)、分類、命名。5、目的基因的獲得途徑6、名詞：基因文庫、cDNA文庫、PCR、質(zhì)粒不親和性第五十九頁，共65頁。60插入鈍化/失活（insertionalinactivation)由于外源