染色體工程操作

關(guān)于染色體工程操作第1頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第2頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體變異染色體結(jié)構(gòu)變異染色體易位：一個(gè)染色體上某一區(qū)段與另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換。染色體缺失：染色體的某一區(qū)段及其帶有的基因一起丟失染色體倒位：染色體上某一區(qū)段連同它帶有的基因順序發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)。染色體重復(fù)：一個(gè)染色體上增加了相同的某個(gè)區(qū)段。第3頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體變異染色體數(shù)變異一是體細(xì)胞內(nèi)以染色體組為基數(shù)進(jìn)行的整倍性變化，以整倍體染色體數(shù)目變化產(chǎn)生的變異會產(chǎn)生多倍體和單倍體；另一種是染色體組內(nèi)的個(gè)別染色體數(shù)目有所增減，使細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)目不是基數(shù)的的完整倍數(shù)，因此被稱為非整倍體。第4頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是染色體工程？染色體工程（chromosomeengineering）是人們按照一定的設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地消減、添加或代換同種或異種染色體，從而達(dá)到定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術(shù)。第5頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月人工誘導(dǎo)多倍體雌、雄核發(fā)育染色體顯微操作技術(shù)染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)人工染色體第6頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)人工誘導(dǎo)多倍體多倍體（polyploid）這個(gè)名詞是由Winkler（1916年）首先使用的，它是指每個(gè)體細(xì)胞中含有三個(gè)或更多染色體組的個(gè)體而言。染色體組成多倍性現(xiàn)象在高等植物中相當(dāng)多，但動物界的多倍體現(xiàn)象卻少得多。自從60年代發(fā)現(xiàn)一種美洲角蛙是一個(gè)確定的四倍體動物以來，學(xué)者們陸續(xù)在低等脊椎動物中發(fā)現(xiàn)許多多倍體動物，包括魚類、兩棲類和爬行類。第7頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月由于多倍體動物具有生長速度快，成活率高及抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，所以人工誘導(dǎo)多倍體、改善動物經(jīng)濟(jì)性狀倍受重視。第8頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月一、人工誘導(dǎo)多倍體的方法生物學(xué)方法Rasch等（1965）年首次證明了三倍體脊椎動物可以通過雜交產(chǎn)生，他們將雌核發(fā)育的二倍體帆鱂（Poeciliaformosa）與P.Vittate雜交，得到三倍體后裔。雌性草魚（2n=48）與雄性三角魴（2n=48）雜交獲得子一代染色體數(shù)目為72的草魴雜種三倍體，其中草魚提供了二倍數(shù)目的染色體（48），三角魴提供了單倍數(shù)目的染色體（24）。第9頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月異育銀鯽與興國紅鯉雜交獲得的復(fù)合四倍體，通過細(xì)胞方法證明其產(chǎn)生的原因是受精卵發(fā)生了兩性融合。為什么種間雜交會導(dǎo)致第二極體不排出，從而導(dǎo)致多倍體產(chǎn)生？第10頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月人工誘導(dǎo)多倍體的方法物理學(xué)方法溫度休克法：包括冷休克法和熱休克法兩種，即用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。此法廉價(jià)、易操作，是誘導(dǎo)動物細(xì)胞多倍體化的常用手段，也有利于養(yǎng)殖場大規(guī)模生產(chǎn)使用。第11頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月水靜壓法：就是采用較高的水靜壓（65kg/cm2）來抑制第二極體的放出或第一次卵裂產(chǎn)生多倍體。此種方法誘導(dǎo)率高（90%~100%）、處理時(shí)間短（3~5min），對受精卵損傷小、成活率高。但該法需要專門的設(shè)備——水壓機(jī)，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產(chǎn)。第12頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月人工誘導(dǎo)多倍體的方法化學(xué)方法細(xì)胞松馳素B：能抑制肌動蛋白聚合成微絲，從而抑制細(xì)胞質(zhì)分裂。秋水仙堿：可以抑制細(xì)胞分裂中紡綞絲的形成，因而抑制有絲分裂。其它藥物：N2O和聚乙二醇等。第13頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、多倍體倍性鑒定的方法核體積測量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與四倍體的核體積之比為1:1.74。蛋白質(zhì)電泳：生化分析：如在關(guān)東系銀鯽中，三倍體紅血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍體。染色體計(jì)數(shù)：是鑒定多倍性的一個(gè)準(zhǔn)確的直接方法。DNA含量測定：流式細(xì)胞儀。第14頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體直接計(jì)數(shù)法準(zhǔn)確、直接，但費(fèi)時(shí)；紅細(xì)胞體積測量法省時(shí)、簡單，在生產(chǎn)現(xiàn)場就能進(jìn)行而廣為人們采用，但缺乏準(zhǔn)確性，亦測不出嵌合體，往往需要校正；DNA含量測定法是較為先進(jìn)常用的方法，其測定快速準(zhǔn)確，并能測出嵌合體，但需要特殊的儀器設(shè)備。第15頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、多倍體動物的應(yīng)用及發(fā)展趨勢多倍體動物的生活力及生長能力。許多誘導(dǎo)的多倍體動物如兩棲類、魚類、貝類等都具有良好的生存力和生長率。誘導(dǎo)三倍體可以增加種間雜種的成活率，三倍體種間雜種可以比二倍體雜種成活得更好一些。第16頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月多倍體動物的性腺發(fā)育及其應(yīng)用三倍體預(yù)期是不育的，許多實(shí)驗(yàn)也都證明了這一點(diǎn)。生產(chǎn)上可以利用這個(gè)不育特性，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動物生長上，避免因繁殖季節(jié)及肉質(zhì)下降而延誤上市時(shí)間或影響商品價(jià)值，也避免了生長停滯和死亡率的增高，縮短了養(yǎng)殖周期、減少了養(yǎng)殖成本，可養(yǎng)成大型個(gè)體。與三倍體不同，四倍體是可育的。目前如何大量誘導(dǎo)四倍體并培育至性成熟，爾后與正常二倍體雜交獲得不育的三倍體，進(jìn)行三倍體育種是許多學(xué)者正在致力研究的課題。第17頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月多倍體動物的其它經(jīng)濟(jì)性狀三倍體虹鱒的魚肉質(zhì)量確實(shí)優(yōu)于二倍體，其抗傳染性造血器官壞死病毒能力較強(qiáng)；三倍體大西洋鮭耐低氧，故可適用于低氧環(huán)境養(yǎng)殖；三倍體香魚對聲音和光線的感受能力比二倍體香魚略顯遲鈍，適于在噪音較大的環(huán)境中放養(yǎng)。第18頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月四、多倍育種中存在的問題準(zhǔn)確的處理時(shí)間；誘導(dǎo)率、成活率及孵化率的提高；準(zhǔn)確可靠的倍性鑒定方法的確定。第19頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)雌、雄核發(fā)育雌核發(fā)育（gynogenesis）是單性生殖的一種，指卵子依靠自己的細(xì)胞核發(fā)育成個(gè)體的生殖行為。同種或異種精子進(jìn)入卵內(nèi)只起刺激卵子發(fā)育的作用，不形成雄性原核和提供遺傳物質(zhì)，其子代的遺傳物質(zhì)完全來自雌核，只具有母本的性狀。雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過紫外線、X射線或γ射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體。第20頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月首先將兩個(gè)不同品系的近交系進(jìn)行雜交。交配后，在精核與卵核尚未融合之前，從母鼠子宮內(nèi)沖取受精卵，并用極細(xì)的吸管將精核去掉。在細(xì)胞松馳素B的處理下使雌核加倍，形成二倍體細(xì)胞。二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)到囊胚期后，移植到養(yǎng)母的子宮內(nèi)，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，直至出生。第21頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月一、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法精子遺傳物質(zhì)的失活：物理方法：采用物理輻射如γ射線、X射線和紫外線等處理精子使精子的遺傳物質(zhì)失活?；瘜W(xué)方法：采用化學(xué)物質(zhì)如甲苯胺藍(lán)、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色體遺傳活性的方法。顯微手術(shù)法：采用顯微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。第22頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法雌核染色體的二倍化溫度休克法流體靜水壓法化學(xué)試劑處理如細(xì)胞松馳素B第23頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、雌核發(fā)育的鑒別形態(tài)生化細(xì)胞學(xué)第24頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、雌核發(fā)育的意義雌核發(fā)育具有產(chǎn)生單性種群的能力。雌核發(fā)育能迅速地產(chǎn)生同源型二倍體克隆。廣泛地用于進(jìn)行基因——著絲點(diǎn)的定位研究。第25頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)染色體的分離染色體的微切割第26頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體分離的基本原理由于熒光染料Hoechst只對A-T特異性染色，而染料Chromomycin只對G-C特異性染色。染色體上DNA的堿基序列是不同的，因此這些特異性染料和不同染色體上DNA結(jié)合的量和比例是不同的。結(jié)合這些染后，再經(jīng)激光照射，染色體就會呈現(xiàn)不同的熒光帶。將特定染色體發(fā)出的熒光波長輸入計(jì)算機(jī)，通過計(jì)算機(jī)控制就可將發(fā)出同一波長的染色體收集在一起，從而實(shí)現(xiàn)染色體的分離。第27頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞分裂同步處理染色體的熒光色素染色染色體的分離第28頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體微切割最常用的方法有兩種微細(xì)玻璃針切割法：采用特細(xì)的玻璃針（尖端直徑約為0.17μm）在倒置顯微鏡下對目的基因所在染色體區(qū)段進(jìn)行切割與分離。顯微激光切割法：將染色體標(biāo)本在底部貼有特殊薄膜的培養(yǎng)皿上制作，利用激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)，依靠高能量激光照射非選擇細(xì)胞或染色體，使其受熱蒸發(fā)，最后只留下目的染色體。第30頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將同特定基因表達(dá)有關(guān)的染色體或染色體片段轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使該基因得以表達(dá)，并能在細(xì)胞分裂中一代又一代地轉(zhuǎn)遞下去。該技術(shù)稱為染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，又稱為染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)。微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Microcellmediatedgenetransfer，MMGT）染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Chromosomemediatedgenetransfer，CMGT）第31頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法微細(xì)胞是指含有一條或幾條染色體，外有一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。第32頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月微細(xì)胞制備微細(xì)胞融合第33頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月微細(xì)胞的制備第34頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月微細(xì)胞的融合第35頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法是指分離得到相應(yīng)的染色體后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的一種技術(shù)。染色體介導(dǎo)技術(shù)一般包括首先誘發(fā)細(xì)胞同步分裂，繼而用秋水仙胺阻斷細(xì)胞分裂于中期，再破碎細(xì)胞，通過離心收集大量的中期染色體，然后通過適當(dāng)?shù)姆植炕蜻M(jìn)一步的分類，即可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。第36頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第37頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月分離染色體染色體的轉(zhuǎn)移受體細(xì)胞的分離與鑒定第39頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月一、細(xì)胞同步化與染色體的分離第40頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、中期染色體的轉(zhuǎn)移第41頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、導(dǎo)入基因的受體細(xì)胞的分離與鑒定分離：利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。鑒定：第42頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)的應(yīng)用前景第43頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)的應(yīng)用前景第44頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)人工染色體染色體要確保在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復(fù)制和向子細(xì)胞中平均分配。它需要3個(gè)關(guān)鍵序列，包括自主復(fù)制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）、著絲粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN)和端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）。第45頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

將3個(gè)關(guān)鍵序列用分子生物學(xué)方法拼接起來就得到人造微小染色體（artificialminichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定、基因治療以及研究染色體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等研究中得到了廣泛的應(yīng)用，具有極為重要的價(jià)值。目前，正在研究或應(yīng)用的有：酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）哺乳動物人工染色體(mammalianartificialchromosome)。第46頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

基于ARS、CEN、T