上海市臨檢中心 二代測(cè)序NGS培訓(xùn)班 4-郭瑋-NGS在液體活檢中的臨床應(yīng)用

NGS在ctDNA檢測(cè)中的臨床應(yīng)用郭

瑋復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科guo.wei@1ctDNA的來(lái)源及特點(diǎn)半衰期短（2

h）含量低片段短（~200bp）ctDNA檢測(cè)對(duì)痕量核酸檢測(cè)技術(shù)提出全新挑戰(zhàn)?。at

Med.

2008,

14(9):985-90.2Proc

Natl

Acad

SciUS

A.

2015,

112(11):3178-9.ctDNA-NGS技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中如何使用？建立技術(shù)：ctDNA-NGS

方法性能驗(yàn)證實(shí)踐技術(shù)：ctDNA-NGS檢測(cè)中的質(zhì)量管理應(yīng)用技術(shù)：ctDNA真實(shí)世界應(yīng)用思考3ctDNA-NGS技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中如何使用？建立技術(shù)：ctDNA-NGS

方法性能驗(yàn)證實(shí)踐技術(shù)：ctDNA-NGS檢測(cè)中的質(zhì)量管理應(yīng)用技術(shù)：ctDNA真實(shí)世界應(yīng)用思考4結(jié)直腸癌ctDNA-NGS檢測(cè)的性能驗(yàn)證

方法學(xué)驗(yàn)證：分析靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性和分析特異性多種檢測(cè)平臺(tái)“頭對(duì)頭”比對(duì)覆蓋大部分臨床有意義的位點(diǎn)

臨床驗(yàn)證：包含已知熱點(diǎn)數(shù)目基因外顯子區(qū)域KRASExon2,

3,

4Exon2,3Exon1581202765檢測(cè)數(shù)據(jù)與臨床結(jié)果驗(yàn)證NRASBRAF

生物信息學(xué)分析和注釋?zhuān)▍⒄誄FDA和FDA）PIK3CAExon9,

205J

MolDiagn.

2017

May;19(3):341-365.結(jié)直腸癌ctDNA多平臺(tái)比對(duì)Patient

enrollment

:?

Pathologically

confirmed

stage

III

and

IV

colorectal

patients?

KRAS/BRAF/NRAS/PIK3CA

mutation

data

through

at

least

onetissue

biopsy

available?

Patient

informed

consent

provided20ml

ofPeripheral

blood

sample

collected

and

cfDNA

extracted臨床樣本的同步比對(duì)20ng

cfDNA20ng

cfDNANGS

analysisofKRAS/BRAF/NRAS/PIK3CA

mutation:?

NGS

vs核酸質(zhì)譜mass-spectrometry

analysisofKRAS/BRAF/NRAS/PIK3CAmutation:?

ddPCR

確認(rèn)TissueKRAS/BRAF/NRAS/PIK3CA

mutation

dataDiscrepancy

analysisof

mutationdetected

by

different

methodsDiscordant

variant

identified

and

re-examined

by

ddPCR?

Tissue

(-)

and

only

NGS(+)?

Tissue

(-)

and

only

mass

spectrometry

(+)?

Tissue

(+)

and

both

NGSand

mass

spectrometry

(-)6結(jié)直腸癌ctDNA多平臺(tái)比對(duì)TCGANGS(n=60)MALDI-TOF/ddPCR(n=60)7ctDNA-NGS技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中如何使用？建立技術(shù)：ctDNA-NGS

方法性能驗(yàn)證實(shí)踐技術(shù)：ctDNA-NGS檢測(cè)中的質(zhì)量管理應(yīng)用技術(shù)：ctDNA真實(shí)世界應(yīng)用思考8ctDNA-NGS檢測(cè)中的質(zhì)量管理-中山醫(yī)院?

質(zhì)控流程設(shè)置QC:QC:QC:QC:1.溶血樣本退收2.全血體積>15ml3.3h內(nèi)完成抽血至檢驗(yàn)科1.樣本cfDNA總量大于20ng2.片段長(zhǎng)度分析:1.建庫(kù)后文庫(kù)濃度>0.5ng/ul2.Pooling的文庫(kù)平均片段長(zhǎng)度700-1100bp1.有效測(cè)序深度

≥30000X2.在靶率≥0.5170-200bp

>

30%3.

2100marker和圖形正常（不出現(xiàn)鋸齒狀的圖形）3.cfDNA長(zhǎng)度：95-1804.Q30>70%5.質(zhì)控品（N、P和NTC）均在控9ctDNA-NGS檢測(cè)中的質(zhì)量管理-中山醫(yī)院?

人員培訓(xùn)記錄

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員上崗證培訓(xùn)

建庫(kù)試劑盒人員培訓(xùn)

測(cè)序儀操作和原理培訓(xùn)

數(shù)字PCR操作培訓(xùn)10ctDNA-NGS技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中如何使用？建立技術(shù)：ctDNA-NGS

方法性能驗(yàn)證實(shí)踐技術(shù)：ctDNA-NGS檢測(cè)中的質(zhì)量管理應(yīng)用技術(shù)：ctDNA真實(shí)世界應(yīng)用思考11患者信息分析-中山醫(yī)院CharacteristicsCRC(n＝181)60±10.5LC(n＝119)63±9.8Age

(years)GenderMale114

(62.98%)67

(37.02%)69(57.98%)50

(42.02%)FemaleTNM

stage,no.

(%)I00II00IIIIV079

(66.39%)40

(33.61%)181(100%)Patient's

tumorload

atblood

samplingP0M0（原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶未切除）P1M0（原發(fā)灶切除）46

(25.42%)114

(62.98%)21

(11.60%)53

(44.54%)9

(7.56%)P1M1（原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶均切除）Tissue

ARMSresult57

(47.90%)Mutationrate49.72%54.32%12關(guān)注克隆造血?

來(lái)源：造血干細(xì)胞的體細(xì)胞突變，非源于生殖細(xì)胞?

特征：多見(jiàn)于老年人，70歲及以上發(fā)生率10~15%55~65%克隆造血點(diǎn)突變?yōu)镃>T?

危險(xiǎn)因素：年齡、吸煙史、放化療?

臨床意義：臨床意義未明Am

JHumGenet.

2017

Jul

6;101(1):50-64.CircRes.

2018

Feb

2;122(3):523-532.13關(guān)注克隆造血14Am

JHumGenet.

2017

Jul

6;101(1):50-64.關(guān)注克隆造血干擾、誤導(dǎo)臨床診療的決策提示腫瘤用藥預(yù)測(cè)腫瘤用藥反應(yīng)克隆造血突變類(lèi)型與組織驅(qū)動(dòng)基因突變類(lèi)似15JAMA

Oncol.

2018

Jun

5.不武斷得出液態(tài)活檢的結(jié)論期待行業(yè)規(guī)范!成熟的臨床檢驗(yàn)：Analytical

validityClinical

validityClinical

utility?

The

mostcommonly

usedapproach

forassessing

analytical

validity

inpublished

studies

ofctDNA

assayshasbeentocompareconcordance

between

variants

detectedintumorsand

plasma.

There

aremanybiologic

factorsthatmayaffectconcordance

in-dependent

ofanalytical

factors(eg,tumortype,

stage,tumorheterogeneity,

timebetween

tumortissueandblood

sampling,

andwhether

thevariant

isclonal

vsubclonal).

Consequently,

analytical

validity

studies

designed

inthisway

mayconfoundissues

ofanalyticalvaliditywith

issues

ofclinical

validity.?

Future

researchinthe

area

ofanalytical

validity

needs

to

focusonmoreandlarger

cross-platformcomparisons

toclearly

definetheperformance

ofvarious

assays.J

ClinOncol.

2018

Jun

1;36(16):1631-1641.16總結(jié)-臨床檢驗(yàn)視角思考梳理優(yōu)先級(jí)